Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5.Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS
Các thí nghiệm được ni cấy trong bình trụ. Mơi trường ni cấy được
điều chỉnh độ pH bằng 5,75 - 5,80 trước khi được khử trùng ở 1210C, 1 atm trong
20 phút. Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, ẩm độ 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
3.5.2. Phương pháp xử lý đột biến
Hạt lan Hoàng thảo Kim Điệp sau 8 tuần nuôi cấy in vitro sẽ tạo
protocorm, các protocorm này sẽ được ngâm trong dung dịch sodium azide theo các công thức khác nhau.
Sodium azide được pha theo các cơng thức thí nghiệm trong box cấy. Sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần và nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản.
3.5.3. Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết theo kit DNeasy plant mini kit (250) của hãng QIAGEN.
3.5.4. Phương pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD
Phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên được tiến hành với tổng thể tích là 10 µl/1 mẫu gồm những thành phần trong bảng Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) H2O 3,5 2x PCR Master mix 5 Primer 10pM 1 DNA 0,5
Chu trình phản ứng PCR gồm 950C trong 3 phút, sau đó là 35 chu trình gồm
950C trong 45 giây, 340C trong 45 giây, 720C trong 2 phút, 720C trong 7 phút và
duy trì ở 40C.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng Ethidium Bromide sau đó quan sát dưới tia UV.
3.5.5. Chỉ tiêu theo dõi
+ Tỷ lệ mẫu sống (%) = Σ số mẫu sống x 100Σ số mẫu đưa vào + Tỷ lệ tạo chồi (%) = Σ số mẫu tạo chồi x 100 Σ số mẫu
+ Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ số chồi đưa vào trong 1 lần Σ số chồi tạo thành sau cấy + Tỷ lệ hình thành rễ (%) = Σ số chồi tạo rễ x 100Σ số chồi theo dõi
+ Số lá (lá/cây) = Σ số cây theo dõi Σ số lá đếm được
+ Chiều cao chồi (cm) = Σ chiều cao các chồi Σ số chồi theo dõi + Số rễ (rễ/mẫu) = Σ số mẫu ban đầu Σ số rễ thu được
+ Chiều dài rễ (cm) = Σ số cây theo dõi Σ độ dài rễ
+ Tỷ lệ chồi dị dạng (%) = Σ tổng số chồi dị dạng x 100Σ số chồi theo dõi
3.5.6. Phân tích số liệu
Số liệu về chỉ tiêu theo dõi được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và SAS 9.1. Các kết quả tính tốn trong bài viết đều được làm trịn tới 2 chữ số thập phân sau dấu phẩy.
Các số liệu để phân tích sự sai khác di truyền được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.2 (Rohlf, 2008) để tính ma trận tương đồng giữa các đơi mẫu theo phương pháp UPGMA theo mức độ xa gần về mặt di truyền và vẽ thành sơ đồ hình cây trong TREE DISPLAY.