2.3.3. Cơ sở di truyền của đột biến
Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ lúc nào và ở bất kỳ tế bào nào. Các tác động lên kiểu hình có thể là những biến đổi nhỏ nhất mà chỉ có thể phát hiện bằng các phương pháp phân tích phân tử đến những biến đổi lớn dẫn đến thay đổi những quá trình cơ bản của tế bào dẫn đến có thể làm chết tế bào hoặc cả cơ thể. Đột biến có thể phân chia theo nhiều cách khác nhau. Ở các sinh vật đa bào, sự phân biệt quan trọng dựa trên các dạng tế bào đầu tiên xảy ra đột biến. Những đột biến xuất
hiện ở các tế bào hình thành giao tử được gọi là đột biến gen nhân (germ-line mutations). Những đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng được gọi là đột biến tế bào sinh dưỡng (somatic mutations) hay còn gọi là đột biến soma. Đột biến soma có thể tạo ra một sinh vật vừa có các mơ tế bào đột biến vừa có các mơ bình thường. Hiện tượng này cịn được gọi là đột biến khảm. Đột biến tế bào sinh dưỡng có thể khơng được di truyền cho thế hệ sau. Đối với cây nhân giống vơ tính thì tuỳ vào vị trí và phần trăm của mơ sinh dưỡng người ta có thể phân lập được hai hoặc ba loại đột biến khác nhau. Ở các loài thực vật bậc cao các đột biến soma có thể được nhân giống vơ tính, do đó vẫn có thể giữ được các đột biến này.
2.4. CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD
Chỉ thị RAPD (Random Amplified polymorphic DNA) được gọi là kỹ thuật phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên. Kỹ thuật này thực chất là quá trình nhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR, sử dụng mồi ngẫu nhiên có chiều dài ngắn (khoảng 10 nucleotide) và có nhiệt độ kéo dài mồi
thấp (34 – 370C), bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự
bổ sung với trình tự của các mồi. Số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài hay vị trí của các đoạn mồi, kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc genome. Kết quả sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện tính đa hình dựa trên các phân đoạn DNA được nhân bản.
Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước: tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng phương pháp PCR với mồi ngẫu nhiên; điện di sản phẩm PCR; xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm chuyên dụng.
Kỹ thuật RAPD không yêu cầu phải biết trước trình tự gen của sinh vật cần nghiên cứu và có thể ứng dụng trên các lồi khác nhau với các mồi chung. Số lượng DNA cần thiết ít và không cần quá tinh sạch. Thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản, dễ dàng phân tích với số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, kỹ thuật này có hạn chế là sản phẩm PCR không ổn định do mồi ngắn, khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy khơng cao (Nguyễn Thị Lang, 2002).
Có thể ứng dụng kỹ thuật RAPD để phân tích, đánh giá đa dạng di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các lồi khác nhau phục vụ cho cơng tác lai tạo giống hoặc phân loại sinh vật, nhận diện chỉ thị phân tử để xác định kiểu gen kiểm sốt hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở sinh vật, xây dựng bản đồ gen.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài tiến hành từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017.
3.3. ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây lan Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum).
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
Protocorm, chồi của cây Hoàng thảo Kim Điệp. Các mồi sử dụng trong chỉ thị phân tử RAPD
Bảng 3.1. Danh sách và trình tự các mồi
STT Mồi Trình tự Tm (0C) Tài liệu ham khảo
1 OPAR02 CACCTGCTGA
34°C
RAPD 10mer KITS
2 OPY04 GGCTGCAATG 3 OPP14 CCAGCCGAAC 4 OPAR16 CCTTGCGCCT 5 OPAE03 CATAGAGCGG 6 OPM12 GGGACGTTGG 7 OPW13 CACAGCGACA 8 OPAR15 ACACTCTGCC 9 OPAE15 TGCCTGGACC 10 OPP05 CCCCGGTAAC 11 RAPD02 GTTTCGCTCC 12 S202 GGAGAGACTC 13 S208 AACGGCGACA
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide sau các lần cấy chuyển với sodium azide sau các lần cấy chuyển
Ở đề tài trước đã tiến hành nghiên cứu tạo đột biến Hoàng thảo Kim Điệp bằng protocorm và đã theo dõi sinh trưởng và tỷ lệ tạo biến dị ở lần cấy chuyển thứ 1, 2. Do vậy, ở đề tài này chúng tôi tiếp tục theo dõi và đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide ở các lần cấy chuyển 3, 4, 5, 6.
3.4.1.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide với các nồng độ khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, 6
Công thức Nồng độ sodium azide (mM)
CT1 0,00
CT2 0,50
CT3 1,00
CT4 2,00
Môi trường MS + 30 g/l sacarose + 8 g/l agar. pH: 5,8. Thời gian xử lý đột biến: 30 phút.
Sau khi xử lý đột biến, mẫu cấy được cấy chuyển liên tiếp (4 tuần 1 lần trong tổng số 6 lần cấy chuyển) trên môi trường MS cơ bản để quan sát và chọn lọc các cá thể biến dị.
3.4.1.2. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide tại các thời gian khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, 6
Công thức Thời gian (phút)
CT1 0
CT2 30
CT3 60
Môi trường MS + 30 g/l sacarose + 8 g/l agar. pH: 5,8. Nồng độ sodium azide xử lý đột biến: 0,5 mM.
Sau khi xử lý đột biến, mẫu cấy được cấy chuyển liên tiếp (4 tuần 1 lần trong tổng số 6 lần cấy chuyển) trên môi trường MS cơ bản để quan sát và chọn lọc các cá thể biến dị.
3.4.2. Nhân dòng cho các cá thể đột biến sau chọn lọc
3.4.2.1. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Công thức Dịng đột biến giả định
CT1 Bình thường (Đ/C) CT2 Dòng đột biến giả định 1 CT3 Dòng đột biến giả định 2 CT4 Dòng đột biến giả định 3 CT5 Dòng đột biến giả định 4 CT6 Dòng đột biến giả định 5 CT7 Dòng đột biến giả định 6
3.4.2.2. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên mơi trường MS + 3 mg/l kinetin của 6 dịng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Cơng thức Dịng đột biến giả định
CT1 Bình thường (Đ/C) CT2 Dịng đột biến giả định 1 CT3 Dòng đột biến giả định 2 CT4 Dòng đột biến giả định 3 CT5 Dòng đột biến giả định 4 CT6 Dòng đột biến giả định 5 CT7 Dòng đột biến giả định 6
3.4.2.3. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Cơng thức Dịng đột biến giả định
CT1 Bình thường (Đ/C) CT2 Dòng đột biến giả định 1 CT3 Dòng đột biến giả định 2 CT4 Dòng đột biến giả định 3 CT5 Dòng đột biến giả định 4 CT6 Dòng đột biến giả định 5 CT7 Dòng đột biến giả định 6
3.4.2.4. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Cơng thức Dịng đột biến giả định
CT1 Bình thường (Đ/C) CT2 Dịng đột biến giả định 1 CT3 Dòng đột biến giả định 2 CT4 Dòng đột biến giả định 3 CT5 Dòng đột biến giả định 4 CT6 Dòng đột biến giả định 5 CT7 Dòng đột biến giả định 6
3.4.3. Đánh giá sự sai khác di truyền của dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến
Các dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến giả định sẽ được đánh giá sự sai khác di truyền bằng kỹ thuật phân tử RAPD.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS
Các thí nghiệm được ni cấy trong bình trụ. Mơi trường nuôi cấy được
điều chỉnh độ pH bằng 5,75 - 5,80 trước khi được khử trùng ở 1210C, 1 atm trong
20 phút. Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, ẩm độ 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
3.5.2. Phương pháp xử lý đột biến
Hạt lan Hoàng thảo Kim Điệp sau 8 tuần nuôi cấy in vitro sẽ tạo
protocorm, các protocorm này sẽ được ngâm trong dung dịch sodium azide theo các công thức khác nhau.
Sodium azide được pha theo các cơng thức thí nghiệm trong box cấy. Sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần và nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản.
3.5.3. Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết theo kit DNeasy plant mini kit (250) của hãng QIAGEN.
3.5.4. Phương pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD
Phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên được tiến hành với tổng thể tích là 10 µl/1 mẫu gồm những thành phần trong bảng Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) H2O 3,5 2x PCR Master mix 5 Primer 10pM 1 DNA 0,5
Chu trình phản ứng PCR gồm 950C trong 3 phút, sau đó là 35 chu trình gồm
950C trong 45 giây, 340C trong 45 giây, 720C trong 2 phút, 720C trong 7 phút và
duy trì ở 40C.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng Ethidium Bromide sau đó quan sát dưới tia UV.
3.5.5. Chỉ tiêu theo dõi
+ Tỷ lệ mẫu sống (%) = Σ số mẫu sống x 100Σ số mẫu đưa vào + Tỷ lệ tạo chồi (%) = Σ số mẫu tạo chồi x 100 Σ số mẫu
+ Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ số chồi đưa vào trong 1 lần Σ số chồi tạo thành sau cấy + Tỷ lệ hình thành rễ (%) = Σ số chồi tạo rễ x 100Σ số chồi theo dõi
+ Số lá (lá/cây) = Σ số cây theo dõi Σ số lá đếm được
+ Chiều cao chồi (cm) = Σ chiều cao các chồi Σ số chồi theo dõi + Số rễ (rễ/mẫu) = Σ số mẫu ban đầu Σ số rễ thu được
+ Chiều dài rễ (cm) = Σ số cây theo dõi Σ độ dài rễ
+ Tỷ lệ chồi dị dạng (%) = Σ tổng số chồi dị dạng x 100Σ số chồi theo dõi
3.5.6. Phân tích số liệu
Số liệu về chỉ tiêu theo dõi được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và SAS 9.1. Các kết quả tính tốn trong bài viết đều được làm trịn tới 2 chữ số thập phân sau dấu phẩy.
Các số liệu để phân tích sự sai khác di truyền được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.2 (Rohlf, 2008) để tính ma trận tương đồng giữa các đơi mẫu theo phương pháp UPGMA theo mức độ xa gần về mặt di truyền và vẽ thành sơ đồ hình cây trong TREE DISPLAY.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nội dung 1. Xác định kỹ thuật xử lý tạo đột biến phù hợp, đánh giá khả năng duy trì biến dị trong giai đoạn ni cấy in vitro
4.1.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide với sodium azide
Protocorm của cây lan được xử lí đột biến bằng sodium azide ở các nồng độ khác nhau trong thời gian 30 phút. Sau 4 tuần, protocorm phục hồi và bắt đầu sinh trưởng sau đó được cấy chuyển liên tiếp cứ 4 tuần 1 lần trên môi trường MS cơ bản để theo dõi sinh trưởng phát triển và sự xuất hiện chồi biến dị.
4.1.1.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide với các nồng độ khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3
Bảng 4.1. Đánh giá sinh trưởng và khả năng duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 3 (sau 4 tuần)
Công thức Nồng độ (mM) Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/cây) Số rễ (rễ/mẫu) Chiều cao (cm) Tỷ lệ chồi biến dị (%) CT1 0,0 1,62d 3,28b 1,40a 1,32b 00,00d CT2 0,5 2,02a 3,76a 1,39a 1,68a 21,43a CT3 1,0 1,94b 3,31b 1,21b 1,17c 17,15b CT4 2,0 1,78c 3,11c 1,02c 1,16c 11,25c
Sau lần cấy chuyển thứ 3, sự sinh trưởng của chồi giữa các cơng thức có sự khác biệt. Qua bảng số liệu có thể thấy chồi bị xử lý với nồng độ sodium azide từ 0,5 mM lên đến 2 mM cho hệ số nhân chồi giảm và khả năng sinh trưởng của chồi cũng giảm. Công thức 2 được xử lí đột biến với nồng độ sodium azide là 0,5 mM cho sinh trưởng phát triển tốt nhất, hệ số nhân đạt 2,02 chồi/mẫu và chiều cao trung bình đạt 1,68 cm, trong khi đó khi tăng nồng độ lên 1 mM thì hệ số nhân giảm xuống 1,94 chồi/mẫu và chiều cao trung bình chỉ đạt 1,17 cm. Tiếp tục tăng nồng độ xử lí lên 2 mM thì các chỉ tiêu này tiếp tục giảm (hệ số nhân: 1,78 chồi/mẫu; chiều cao trung bình: 1,16 cm). Cơng thức đối chứng khơng được xử lí đột biến cho sinh trưởng khá tốt tuy nhiên thấp hơn so với công thức 2. Sau
3 lần cấy chuyển, tỷ lệ chồi biến dị có sự chênh lệch giữa các công thức. Công thức đối chứng không xuất hiện các chồi biến dị. Khi sử dụng nồng độ 0,5 mM, tỷ lệ thu được là 21,43 %, tỷ lệ này giảm dần khi nồng độ tăng dần, với nồng độ 2 mM thì tỷ lệ xuất hiện biến dị chỉ đạt 11,25 %.