và nhóm đối chứng
Kết quả trên hình cho thấy: rõ ràng, ngay ở các cá thể đối chứng đã có sự khác biệt di truyền nhưng rất nhỏ và điều này là hoàn toàn dễ hiểu do vật liệu chúng tôi sử dụng khi xử lý là protocorm phát triển từ hạt và do vậy có sự phân
ly về kiểu gen. Sự khác biệt rất nhỏ về kiểu gen với các cây đối chứng có thể giải thích là do cây D. chrysotoxum đã được biết đến là cây ưa thích tự thụ hơn so với giao phấn chính vì vậy sự khác biệt về di truyền sẽ ít so với các giống lan khác (Ramawat et al., 2014). Điều thú vị là sự khác biệt di truyền là rất rõ ràng giữa cá thể đối chứng và cá thể đột biến khi các cá thể đối chứng và các cá thể đột biến được xếp vào hai nhóm khác biệt có ý nghĩa thống kê (được biểu thị bởi hai nhóm có màu khác biệt). Kết quả trên chứng tỏ các cá thể đột biến biểu hiện qua kiểu hình đều là những cá thể bị đột biến gen.
4.2. THẢO LUẬN
Nội dung 1. Xác định được kỹ thuật xử lý tạo đột biến phù hợp, đánh giá khả năng duy trì biến dị trong giai đoạn ni cấy in vitro
Đến nay, trên thế giới cũng chưa có nhiều báo cáo về việc tạo đột biết trên
cây Dendrobium chrysotoxum. Một số loài lan thuộc chi Dendrobium được
nghiên cứu tạo đột biến bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Trong nghiên cứu này, kết quả khi sử dụng sodium azide nồng độ 0,5 mM trong 30 phút để gây đột biến các chồi lan Dendrobium chrysotoxum đã cho tỷ lệ tạo đột biến cao nhất. Khi sử dụng nồng độ chất tạo đột biến cao và xử lí trong thời gian dài thì khả năng phát triển của chồi có xu hướng giảm đi. Kết quả này cũng được chỉ ra khi Wannajindaporn et al. (2016) nghiên cứu tạo đột biến trên
PLB cây Dendrobium ‘Earsakul’ bằng sodium azide. Khi sử dụng nồng độ 0,1
mM sau 2 tuần nuôi cấy 30% PLB bị chết, khi tăng lên 0,5 mM tỷ lệ chết là 50%. Khosravi et al. (2009) tiến hành nghiên cứu xử lý đột biến Dendrobium Serdang beauty bằng colchicine ở các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25 mg/l, kết quả khi sử dụng nồng độ colchicine là 25 mg/l thì tỷ lệ tạo đột biến cao nhất (đạt 26%), tuy nhiên các chồi này có trọng lượng tươi giảm rõ rệt so với các công thức sử dụng nồng độ thấp hơn. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD cho thấy cây đột biến tạo được từ việc xử lý đột biến bằng 25 mg/l colchicine phát hiện đa hình cao hơn các cây đột biến tạo được bằng các nồng độ khác và tính đa hình cũng rất cao so với 13 loài khác trong chi Dendrobium. Ariffin (2000) đã sử dụng vật liệu là PLB của Dendrobium Sonia Kai để xử lí đột biến bằng cách chiếu xạ ở 35 Gy4 sau đó ni cấy các PLB này trên môi trường MS. Các cây đột biến thu được sau khi trồng đã cho ra các màu sắc hoa và hình thái hoa khác nhau. Kết quả phân tích DNA cũng cho thấy sự đa hình giữa các cây đột biến thu được so với cây đối chứng khơng xử lí đột biến.
Dendrobium chrysotoxum còn được nghiên cứu tạo đột biến bằng
colchicine. Các PLB được xử lý đột biến bằng cách đưa 0,04% colchicine vào môi trường bán rắn VW trong thời gian 1 ngày. Kết quả khoảng 84% PLB có khả năng sống sót (Atichart, 2013).
Nội dung 2. Nghiên cứu nhân nhanh, tạo dòng cho các cá thể đột biến chọn lọc được
Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Song và cs. (2011) đã nghiên cứu nhân giống in
vitro Dendrobium chrysotoxum. Sau khi tạo được protocorm bằng hạt 3 tháng
tuổi, các protocorm được ni cấy tạo chồi, sau đó chồi sẽ nuôi cấy nhân nhanh trên môi trường MS + 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA + 15% nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 30 g/l sucarose +8 g/l agar. Môi trường MS + 1,0 mg/l NAA + 15% nước dừa + 20 g/l sucarose + 8 g/l agar thích hợp cho việc tạo rễ của chồi.
Mục đích của nghiên cứu này nhằm so sánh khả năng sinh trưởng và phát triển của các dịng đột biến tạo được trên mơi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau đồng thời nhân dòng được các cá thể biến dị. Kết quả chỉ ra có sự chênh lệch về sự sinh trưởng giữa các dòng đột biến tạo được. Tuy nhiên, qua kết quả cũng có thể thấy được các dịng lan Hồng thảo Kim Điệp sau 6 tuần nuôi trên môi trường bổ sung riêng rẽ BA, kinetine hay kết hợp BA với IBA và kinetine với IBA thì sinh trưởng có sự khác nhau. Việc kết hợp giữa auxin và cytokinine ở tỷ lệ thích hợp có khả năng làm tăng sinh trưởng của chồi. Theo kết quả của Nguyễn Thị Sơn và cs. (2014), môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp với 0,2 mg/l NAA tốt nhất cho việc phát triển của chồi lan
Dendrobium officinale Kimura et Migo.
Sự kết hợp giữa 3 mg/l BA với 0,5 mg/l IBA là tốt nhất cho việc nhân nhanh các chồi lan Hoàng thảo Kim Điệp đột biến. Khatun et al. (2010) cũng đã đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp giữa BA và IBA đến khả năng phát triển của
Dendrobium hybrid orchid. Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa BS và IBA đã làm
tăng trọng lượng của PLB Dendrobium hybrid orchid. Chiều dài lá cao nhất cũng thu được khi kết hợp 1,0 mg/l BA + 1,0 mg/l IBA, trong khi chỉ số này là thấp nhất khi kết hợp 0,5 mg/l IAA và 1,0 mg/l IBA. Chiều rộng lá cao nhất khi bổ sung 0,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA. Kết luận của nghiên cứu chỉ ra việc kết hợp 1,0 mg/l BA với 1,0 mg/l IBA là tốt nhất cho việc tái sinh cây lan Dendrobium hybrid orchid.
Gantait et al. (2009) đã đánh giá tác động của 3 loại auxin là IBA, NAA và IAA khi kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tạo rễ in vitro của Dendrobium
chrysotoxum Lindl. cv. Golden Boy. Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung
0,2 mg/l IBA và 2 g/l than hoạt tính có khả năng tạo rễ sớm và số rễ cũng như chiều dài rễ tốt hơn so với NAA hoặc IAA.
Nội dung 3. Đánh giá sự sai khác di truyền của dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến
Aloysius et al. (2017) đã tiến hành tạo đột biến hạt Spathoglottis plicata
bằng cách chiếu xạ tia X với liều 12 – 18 rad. Các cây con đột biến được đánh giá đa dạng di truyền bằng 9 mồi RAPD. Kết quả sau khi điện di cho thấy các cây con đột biến cho sự đa hình với tỷ lệ 81,65%, trong khi nhóm các cây khơng đột biến cho sự đồng nhất cao. Phân tích phân tử cho thấy có khoảng cách di truyền giữa cây con đột biến so với cây không được tạo đột biến.
Kết quả trong nghiên cứu này, 12 dịng đột biến được lựa chọn thơng qua việc đánh giá sự khác biệt về mặt hình thái so với sự phát triển của các cây Hồng thảo Kim Điệp bình thường, tuy một số dịng vẫn có sự gần gũi với cây mẹ ban đầu nhưng về mặt di truyền các dịng đều có thể hiện sự khác biệt so với
cây không đột biến. Wannajindaporn et al. (2014) đã tạo được 28 cây
Dendrobium ‘Earsakul’ có khả năng bị đột biến khi gây đột biến bằng sodium
azide nồng độ từ 0 – 5 mM trong 1 giờ. Tuy nhiên sau khi phân tích đa hình bằng 12 mồi ISSR, trong số 28 cây chỉ có 15 cây có sự thay đổi về cấu trúc di truyền so với cây đối chứng và được xác định là đột biến. Năm 2016, Wannajindaporn
et al. cũng tiến hành nghiên cứu tạo đột biến Dendrobium ‘Earsakul’ biến bằng
sodium azide, các cây đột biến được phân tích phân tử bằng 10 chỉ thị ISSR. Kết quả trong số 24 cây được phân tích có 20 cây thể hiện sự thay đổi về cấu trúc DNA. Trong 181 băng thu được có 63 băng đa hình (34,81%) khi sử dụng chỉ thị ISSR để phân tích.
Bằng việc sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích sự sai khác di truyền giữa các dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến đã chỉ ra được sự khác về mặt di truyền của các dòng đột biến thu được.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Chồi lan Hồng thảo Kim Điệp được xử lí bằng Sodium azide nồng độ 0,5 mM trong 30 phút có khả năng tạo đột biến cao nhất. Sự tác động của sodium azide là hoàn toàn ngẫu nhiên.
- Qua 6 lần cấy chuyển các cá thể biến dị thu được vẫn duy trì biến dị một cách ổn định. Hình thái biến dị chủ yếu là mọc nhiều chồi trên cùng một nách lá, một số dạng khác thu được như lá có xẻ thùy, lá có kẻ sọc trắng.
- Trong 12 cá thể biến dị thu được, tiến hành nghiên cứu nhân dòng 6 cá thể (dòng 1 – dòng 6). Trong 6 dịng đó, sinh trưởng của dịng đột biến 4 là tốt nhất, dòng 1 và dòng 5 sinh trưởng kém nhất.
- Sau khi phân tích đa dạng di truyền giữa 12 dịng đột biến, dịng 12 có sự khác biệt lớn nhất về mặt di truyền so với các dòng đối chứng và so với các dòng đột biến khác.
5.2. KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nhân dòng và tiến hành ni cây ngồi vườn ươm để đánh giá toàn diện về khả năng duy trì biến dị của các dịng đột biến thu được.
- Tiếp tục khảo sát tính đa dạng di truyền bằng các chỉ thị khác như SSR, ISSR… để có kết quả chính xác và độ tin cậy cao trong việc đánh giá sự sai khác di truyền giữa các dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Đào Thị Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2008). Giáo trình hoa lan. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Dương Đức Huyến (2007). Thực vật chí Việt Nam, 9 – Họ lan (Orchidceae). NXB Khoa học và Kỹ thuật.
3. Trần Hợp (2000). Cây cảnh, hoa Việt Nam. NXB Nông nghiệp.
4. Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013). Nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ lâm nghiệp,(3). tr. 16-21
5. Nguyễn Thị Lang (2002). Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. NXB Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam.
6. Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009). Nhân giống Lan Dendronbium anosmum,
Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô. Nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendronium mini thích hợp và cho hiệu quả cao.
7. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012). Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium Fimbriatum Hook. (Hoàng Thảo long nhãn). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10 (2). tr. 263 – 271.
8. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch (2014). Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì). Tạp chí Khoa học và Phát triển,
12 (8). tr. 1274-1282.
9. Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Văn Vinh (2010). Nghiên cứu khả năng nhân giống loài lan Hoàng Thảo sáp (Dendrobium crepidatum Lindl. & Paxt.) in vitro. Tạp chí
Khoa học và Cơng nghệ, 48 (5). tr. 89-95.
10. Nguyễn Văn Song, Phan Hùng Vĩnh, Trương Thị Bích Phượng (2011). Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) – Một lồi lan rừng có
nguy cơ tuyệt chủng. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 64.tr. 127-136.
11. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001). Vi nhân giống phong lan nhóm
Dendrobium trên quy mơ cơng nghiệp, nhân giống in vitro. Tạp chí Khoa học
12. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang (2010). Ảnh hưởng của giá thể trồng đến q trình sinh trưởng của lan Hồng thảo trúc đen (Dendrobium
hancockii rolfe). Tạp chí Khoa học và Phát triển. 8 (5). tr. 757-764.
13. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Nhân giống in vitro loài lan bản địa
Dendrobium nobile lindl. Tiếng Anh:
14. Atichart, P. (2013). Polyploid induction by colchicine treatments and plant regeneration of Dendrobium chrysotoxum. Thai Journal of Agricultural Science, 46(1), 59-63.
15. Aloysius, S., Purwantoro, A., Dewi, K., & Semiarti, E. (2017). Improvement of genetic variability in seedlings of Spathoglottis plicata orchids through X-ray irradiation. Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 18(1).
16. Anjum, S., Zia, M., & Chaudhary, F. (2006). Investigations of different strategies for high frequency regeneration of Dendrobium malones ‘Victory’. African Journal of Biotechnology, 5(19).
17. Ariffin, S. (2000). Induced Mutation of Dendrobium Orchid.
18. Chung, H. H., Chen, J. T., & Chang, W. C. (2007). Plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Dendrobium. Biologia plantarum, 51(2), 346-350.
19. Du, G., Lai, T. C., & Yang, H. Y. (2012). Study on the tissue culture of Dendrobium aphyllum (Roxb) CEC Fisch. North Hort, 8, 140-141.
20. Gantait, S., Mandal, N., & Das, P. K. (2009). Impact of auxins and activated charcoal on in vitro rooting of Dendrobium chrysotoxum Lindl. cv. Golden
Boy. Journal of Tropical Agriculture, 47(1), 84-86.
21. Hossain, M. M., Sharma, M., & Pathak, P. (2013). In vitro propagation of Dendrobium aphyllum (Orchidaceae)—seed germination to flowering. Journal of plant biochemistry and biotechnology, 22(2), 157-167.
22. Jain, R., & Babbar, S. B. (2005). Guar gum and isubgol as cost-effective alternative gelling agents for in vitro multiplication of an orchid, Dendrobium chrysotoxum. Current Science, 292-295.
23. Khosravi, A. R., Kadir, M. A., Kadzemin, S. B., Zaman, F. Q., & De Silva, A. E. (2009). RAPD analysis of colchicine induced variation of the Dendrobium
24. Khatun, H., Khatun, M. M., Biswas, M. S., Kabir, M. R., & Al-Amin, M. (2010).
In vitro growth and development of Dendrobium hybrid orchid. Bangladesh Journal of Agricultural Research, 35(3), 507-514.
25. Nayak, N. R., Sahoo, S., Patnaik, S., & Rath, S. P. (2002). Establishment of thin cross section (TCS) culture method for rapid micropropagation of Cymbidium aloifolium (L.) Sw. and Dendrobium nobile Lindl.(Orchidaceae). Scientia Horticulturae, 94(1), 107-116.
26. Nongdam, P., & Tikendra, L. (2014). Establishment of an efficient in vitro
regeneration protocol for rapid and mass propagation of Dendrobium chrysotoxum Lindl. using seed culture. The Scientific World Journal, 2014.
27. Martin, K. P., & Madassery, J. (2006). Rapid in vitro propagation of Dendrobium hybrids through direct shoot formation from foliar explants, and protocorm-like bodies. Scientia Horticulturae, 108(1), 95-99.
28. Paul, S., Kumaria, S., & Tandon, P. (2011). An effective nutrient medium for asymbiotic seed germination and large-scale in vitro regeneration of Dendrobium
hookerianum, a threatened orchid of northeast India. AoB Plants, 2012, plr032.
29. Rangsayatorn, N. (2009). Micropropagation of Dendrobium draconis Rchb. f.
from thin cross-section culture. Scientia horticulturae, 122(4), 662-665.
30. Ramawwat, K. G., Mérillon, J. M., & Shivanna, K. R. (2014). Reproductive biology of plants. Boca Raton ; London ; New York : CRC Press, Taylor & Francis Group.
31. Sharma, U., Rao, V. R., Mohan, J. S. S., & Reddy, A. S. (2007). In vitro
propagation of Dendrobium microbulbon A. Rich―A rare ethnomedicinal herb. 32. Wannajindaporn, A., Poolsawat, O., Chaowiset, W., & Tantasawat, P. A. (2014).
Evaluation of genetic variability in in vitro sodium azide-induced Dendrobium
‘Earsakul’mutants. Genet Mol Res, 13(3), 5333.
33. Wannajindaporn, A., Kativat, C., & Tantasawat, P. A. (2016). Mutation Induction of Dendrobium ‘Earsakul’Using Sodium Azide. HortScience, 51(11), 1363-1370.
PHỤ LỤC
Môi trường Murashige & Skoog (MS, 1962)
Thành phần
Lượng lấy
1l dung dịch mẹ 1l môi truờng sử dụng 1. Đa lượng
NH4NO3 KNO3
MgSO4.7H2O KH2PO4
CaCl2 (Pha riêng)
(g) 33, 00 38,00 10,00 3,40 6,60 50 ml/l 2. Vi lượng H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.4H2O KI MoNa2.2H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O (mg) 620,00 2230,00 860,00 83,00 25,00 2,50 2,50 10 ml/l 3. Sắt FeSO4.7H2O Na2EDTA (g) 5,56 7,46 5 ml/l 4. Vitamin Glycine Axit Nicotinic (B5) Pyridoxin (B6) Thyamin HCl (B1) Inositol (mg) 400 100 100 20 100 5 ml/l
Kết quả xử lí số liệu bằng phần mềm iristart 5.0 Ảnh hưởng của nồng độ
Lần cấy chuyển 3
he so nhan Run 20:21 Thursday, September 27, 2017 1
The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values rep 3 1 2 3 trt 4 1 2 3 4
Number of Observations Read 13 Number of Observations Used 12 he so nhan Run 20:21 Thursday, September 27, 2017 2
The GLM Procedure Dependent Variable: hsn
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 5 0.28910833 0.05782167 56.11 <.0001
Error 6 0.00618333 0.00103056 Corrected Total 11 0.29529167
R-Square Coeff Var Root MSE hsn Mean 0.979060 1.743899 0.032102 1.840833
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
rep 2 0.00701667 0.00350833 3.40 0.1028