Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả nghiên cứu
4.1.3. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3mg/l BA
BA của 6 dòng dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Sau 6 lần cấy chuyển, chúng tôi thu được 12 cá thể đột biến. Mặc dù vậy, trong thí nghiệm này, chúng tơi chỉ tiến hành nhân dòng cho 6 cá thể đột biến với kiểu hình rõ ràng nhất và so sánh với dịng đối chứng khơng đột biến. Các đoạn thân mang mắt ngủ được cấy trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.9.
Bảng 4.9. Sinh trưởng phát triển của các dịng đột biến giả định trên mơi trường MS + 3 mg/l BA (sau 6 tuần)
Cơng thức Dịng đột biến Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Tỉ lệ ra rễ (%) 1 Bình thường (ĐC) 2,19c 1,23d 3,00c 100,00a 2 Dòng đột biến giả định 1 1,90d 1,17e 3,00c 100,00a 3 Dòng đột biến giả định 2 3,05a 1,34b 3,20b 100,00a 4 Dòng đột biến giả định 3 2,10c 1,30c 3,68a 100,00a 5 Dòng đột biến giả định 4 2,76b 1,41a 3,33b 100,00a 6 Dòng đột biến giả định 5 2,19c 1,26d 2,91c 100,00a 7 Dòng đột biến giả định 6 2,81b 1,37b 3,02c 100,00a CV (%) 3,40 1,57 3,28 LSD (0,05) 0,15 0,04 0,18
BA có tác động tích cực đến khả năng nhân nhanh của các đoạn thân lan. Sau 4 tuần các dịng được ni cấy đều có sinh trưởng tốt, số lá trung bình đạt 3 lá. Chiều cao chồi của các dòng đột biến từ 1,17 cm – 1,41 cm, trong khi dòng đối chứng là 1,23 cm. Tất cả các chồi được nuôi cấy đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Trong 6 dòng đột biến thu được, dòng 4 sinh trưởng tốt nhất, các chỉ tiêu về số chồi, số lá và chiều cao chồi đều cao hơn cây đối chứng. Dòng 1 sinh trưởng kém hơn các dòng khác, chiều cao chỉ đạt 1,17 cm, số chồi/mẫu đạt 1,90 trong khi các dòng còn lại đều cho số chồi/mẫu trên 2 chồi.
Hình 4.9. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh các dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân trên môi trường MS + 3 mg/l BA 4.1.4. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên mơi trường MS + 3 mg/l kinetine của 6 dịng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Bảng 4.10. Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin (sau 6 tuần)
Cơng thức Dịng đột biến Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Tỉ lệ ra rễ (%) CT1 Bình thường (Đ/C) 1,76c 0,92c 2,11a 90,48ab CT2 Dòng đột biến giả định 1 2,10b 1,02b 2,09a 80,95b CT3 Dòng đột biến giả định 2 1,62c 0,90c 1,09d 61,90c CT4 Dòng đột biến giả định 3 1,38d 1,07b 1,66b 100,00a CT5 Dòng đột biến giả định 4 2,48a 0,87c 1,04d 100,00a CT6 Dòng đột biến giả định 5 2,43a 1,14a 2,16a 100,00a CT7 Dòng đột biến giả định 6 1,10e 0,79d 1,39c 66,67c CV (%) 6,04 3,12 4,43 7,42 LSD (0.05) 0,20 0,05 0,13 11,32
là khơng có hiệu quả, các chỉ tiêu về số chồi, số lá và chiều cao chồi đều rất thấp khi cấy trên môi trường có bổ sung kinetin. Chiều cao trung bình của chồi chỉ đạt từ 0,79 cm (dòng 6) – 1,14 cm (dịng 5), số lá trung bình cũng chỉ đạt 1-2 lá/chồi. Các dòng đột biến 3, 4, 5 cho tỷ lệ tạo rễ là 100%, trong khi các dòng 1, 2, 6 cho tỷ lệ tạo rễ thấp hơn. Khi sử dụng 3 mg/l BA thì dịng 4 cho sinh trưởng cao nhất, tuy nhiên dưới tác động của kinetine dòng 4 lại tỏ ra phát triển kém hơn các dòng khác.
Hình 4.10. Sinh trưởng phát triển của các dịng đột biến giả định trên mơi trường MS + 3 mg/l kinetin
4.1.5. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân BA + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Sự kết hợp giữa BA và IBA đã giúp cho sự sinh trưởng của chồi Hoàng thảo Kim Điệp tốt hơn. Chiều cao chồi cao nhất đạt 1,74 cm ở dòng đột biến 4, dòng 4 cũng cho số chồi/mẫu cao đạt 3,14. Số chồi/mẫu cao nhất thu được ở dòng 2 là 3,24 chồi/mẫu, tuy nhiên chỉ tiêu này giữa dịng 4 và dịng 2 khơng có sự khác biệt. Số lá trung bình của dịng 4 là 3,58 lá/chồi, dịng 1 cho số lá trung bình cao nhất là 3,85 lá/chồi nhưng chiều cao trung bình của chồi chỉ đạt 1,42 cm. Như
vậy, trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA, dịng đột biến 4 có khả năng sinh trưởng phát triển tốt nhất trong khi đó dịng 5 là kém nhất.
Bảng 4.11. Sinh trưởng phát triển của các dịng đột biến giả định trên mơi trường MS + 3 mg/l BA + 0.5 mg/l IBA (sau 6 tuần)
Cơng thức Dịng đột biến Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Tỉ lệ ra rễ (%) CT1 Bình thường (Đ/C) 2,91b 1,47d 3,26d 90,47b CT2 Dòng đột biến giả định 1 2,24d 1,42de 3,85a 95,24ab CT3 Dòng đột biến giả định 2 3,24a 1,66b 3,42c 100,00a CT4 Dòng đột biến giả định 3 3,09a 1,56c 3,19d 100,00a CT5 Dòng đột biến giả định 4 3,14a 1,74a 3,58b 100,00a CT6 Dòng đột biến giả định 5 2,48c 1,30e 3,52bc 100,00a CT7 Dòng đột biến giả định 6 3,24b 1,61bc 2,93e 100,00a CV (%) 3,41 2,67 1,71 4,31 LSD (0.05) 0,18 0,07 0,10 7,51
Hình 4.11. Sinh trưởng phát triển của các dịng đột biến giả định trên mơi trường MS + 3 mg/l BA + 0.5 mg/l IBA
4.1.6. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetine + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp kinetine + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
Bảng 4.12. Sinh trưởng phát triển của các dịng đột biến giả định trên mơi trường MS + 3 mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA (sau 6 tuần)
Cơng thức Dịng đột biến giả định Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Tỉ lệ ra rễ (%) CT1 Bình thường (Đ/C) 2,34d 1,17d 2,24bc 66,67d CT2 Dòng đột biến giả định 1 2,19d 1,23c 2,39b 66,67d CT3 Dòng đột biến giả định 2 3,19ab 1,28b 2,11dc 85,71bc CT4 Dòng đột biến giả định 3 3,38a 1,26bc 2,37b 95,24ab CT5 Dòng đột biến giả định 4 3,19ab 1,36a 2,03d 100,00a CT6 Dòng đột biến giả định 5 3,00b 1,16d 2,36b 85,71bc CT7 Dòng đột biến giả định 6 2,66c 1,29b 2,61a 76,19dc CV (%) 4,90 1,72 3,81 8,03 LSD (0.05) 0,25 0,34 0,16 11,76
Khi kết hợp giữa kinetine và IBA thì sinh trưởng của chồi lan Hoàng thảo Kim Điệp tốt hơn so với việc sử dụng riêng rẽ kinetine. Trên môi trường MS + 3 mg/l kinetine + 0,5 mg/l IBA sự phát triển của các chồi cũng thể hiện sự khác biệt. Dòng 4 vẫn sinh trưởng tốt hơn các dòng khác khi các chỉ tiêu số chồi trung bình (3,19 chồi/mẫu), chiều cao chồi (1,36 cm), tỷ lệ ra rễ (100%) đều đạt cao nhất. Dòng 1 khi cấy trên môi trường này cho khả năng sinh trưởng và hệ số nhân tốt hơn đối chứng. Dòng 5 cho khả năng phát triển thấp nhất khi chiều cao trung bình chỉ đạt 1,16 cm, tỷ lệ tạo rễ đạt 85,71 %.
Hình 4.12. Sinh trưởng phát triển của các dịng đột biến giả định trên mơi trường MS + 3 mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA
Như vậy, sau 6 tuần nhân nhanh các dòng đột biến trên mơi trường MS có bổ sung BA, kinetine riêng rẽ và kết hợp giữa BA + IBA và kinetine + IBA, dòng đột biến 4 có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, dòng đột biến 1 và 2 sinh trưởng kém nhất. Môi trường MS + 3 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA có tác động tốt nhất đến sự phát triển của các dòng đột biến.
Nội dung 3. Đánh giá sự sai khác di truyền của dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến
4.1.7. Kết quả tách chiết DNA tổng số
12 dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến, 6 dịng khơng đột biến và 1 mẫu là cây lan Phi điệp in vitro được tách chiết DNA tổng số để tiến hành phân tích theo chỉ thị RAPD nhằm đánh giá sự sai khác di truyền giữa các dịng.
Hình 4.13. Kết quả điện di DNA tổng số 12 dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến và 7 dòng đối chứng
Ghi chú: 1: Dòng lan đối chứng ; 2: ĐC 6; từ 3-14: tương ứng từ dòng 1 đến dòng 12; từ 15-19: cây đối chứng từ ĐC 1 đến ĐC 5
Kết quả tách chiết DNA tổng số cho thấy các mẫu DNA thu được cho vạch băng sáng, không lẫn tạp chất, các đoạn DNA khơng bị đứt gẫy. Vì vậy các mẫu DNA này có thể sử dụng trong các bước tiếp theo để phân tích đánh giá đa dạng di truyền giữa các dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến thu được.
4.1.8. Kết quả phân tích RAPD
Bảng 4.13. Kết quả sử dụng 13 mồi RAPD
STT Tên mồi Tổng số băng Số băng đa hình Tỷ lệ đa hình (%) 1 OPAE 15 110 53 48,18 2 OPAR 16 236 46 19,49 3 RAPD 02 145 107 73,79 4 OPAE03 148 15 10,14 5 OPM 12 165 108 65,45 6 OPP 05 184 32 17,39 7 OPP 14 123 19 15,45 8 OPW 13 113 94 83,19 9 OPY 04 180 85 47,22 10 S 202 139 120 86,33 11 S 208 145 31 21,38 12 OPAR 02 156 118 75,64 13 OPAR 15 165 70 42,42 Tổng 2009 898
Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền của 12 dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến bằng 13 mồi RAPD cho thấy tất cả các mồi đều cho băng đa hình. Tỷ lệ đa hình đạt được từ 10,14 % (mồi OPAE 03) đến 86,33 % (mồi S 202) (bảng 4.13). 13 mồi thể hiện sự đa hình đã tạo ra 898 băng đa hình.
Bảng 4.15. Hệ số tương đồng di truyền của 12 dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến và 7 dòng đối chứng ĐC1 ĐC2 ĐC3 ĐC4 ĐC5 ĐC6 LK D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 ĐC1 1 ĐC2 0,98 1 ĐC3 0,98 1 1 ĐC4 0,98 1 1 1 ĐC5 0,98 1 1 1 1 ĐC6 0,98 0,95 0,95 0,95 0,95 1 LK 0,82 0,83 0,83 0,83 0,83 0,81 1 D1 0,91 0,93 0,93 0,93 0,93 0,88 0,82 1 D2 0,88 0,86 0,86 0,86 0,86 0,89 0,84 0,88 1 D3 0,87 0,89 0,89 0,89 0,89 0,88 0,78 0,85 0,83 1 D4 0,84 0,87 0,87 0,87 0,87 0,84 0,74 0,83 0,76 0,85 1 D5 0,91 0,89 0,89 0,89 0,89 0,91 0,77 0,84 0,84 0,89 0,85 1 D6 0,92 0,95 0,95 0,95 0,95 0,9 0,81 0,92 0,87 0,91 0,89 0,91 1 D7 0,89 0,91 0,91 0,91 0,91 0,87 0,79 0,89 0,84 0,88 0,84 0,85 0,92 1 D8 0,86 0,88 0,88 0,88 0,88 0,84 0,74 0,89 0,79 0,85 0,88 0,85 0,92 0,89 1 D9 0,85 0,86 0,86 0,86 0,86 0,82 0,78 0,88 0,8 0,84 0,84 0,83 0,9 0,87 0,95 1 D10 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,71 0,8 0,79 0,82 0,78 0,85 0,86 0,83 0,83 0,81 1 D11 0,82 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,75 0,79 0,77 0,8 0,79 0,88 0,84 0,79 0,85 0,86 0,85 1 D12 0,76 0,78 0,78 0,78 0,78 0,75 0,74 0,76 0,69 0,78 0,79 0,8 0,79 0,76 0,82 0,81 0,8 0,89 1
Hình 4.14. Sơ đồ hình cây biểu hiện mối tương quan về di truyền của 12 dòng Hồng thảo Kim Điệp đột biến và 7 dịng đối chứng
Hệ số tương đồng được xác định bằng phần mềm NTSYS 2.1 (bảng 4.15). Hệ số tương đồng phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các dịng Hồng thảo Kim Điệp, hệ số tương đồng càng lớn thì khoảng cách di truyền giữa các dịng càng nhỏ và ngược lại.
Giữa các dịng lan Hồng thảo Kim Điệp khơng đột biến có sự khác nhau về mặt di truyền nhưng không lớn, hệ số di truyền nằm trong khoảng từ 0,95 đến 1. Kết quả trên chứng tỏ các dòng đối chứng rất gần nhau về mặt di truyền.
Dịng đột biến 6 có mức độ tương đồng nhiều nhất so với 6 dòng đối chứng, khoảng 94% trong khi đó dịng D10, D11 và D12 lại có khoảng cách di truyền lớn nhất so với tất cả các dòng còn lại với sự khác biệt khoảng 20% (hệ số tương đồng khoảng 80%). Trong số các dòng đột biến, mức độ tương đồng của dòng D8 và D9 là nhiều nhất, gần 95% trong khi đó các dịng khác khoảng 89% (dịng D3 và D5, dòng D11 và dòng D12).
Sự cách biệt về hệ số tương đồng giữa các dòng đột biến với các dịng đối chứng đã cho thấy có sự biến đổi trong DNA của các cây Hoàng thảo Kim Điệp khi được xử lí đột biến bằng sodium azide.
Ở mức tương đồng di truyền 0,85 thu được 5 nhóm di truyền:
- Nhóm 1: Gồm 6 dịng đối chứng và 8 dòng đột biến 6, 1, 7, 3, 5, 8, 9, 4. - Nhóm 2: Gồm 1 dịng lan đột biến là dịng 2.
- Nhóm 3: Gồm 1 dịng lan phi điệp khác lồi. - Nhóm 4: Gồm 1 dịng lan đột biến là dịng 10.
- Nhóm 5: Gồm 2 dòng lan đột biến là dòng 11 và dịng 12
Bên cạnh phân tích sự khác biệt di truyền nhờ thông qua hệ số tương đồng Sokal and Michener (1958), chúng tôi cũng sử dụng phương pháp phân tích thành phần chính (Principle Component Analysis – PCA) để mơ hình hóa sự khác biệt giữa các cá thể trong nhóm đối chứng và nhóm các cá thể đột biến giả định. Kết quả được thể hiện trên hình sau:
Hình 4.15. Phân tích thành phần chính của 12 dịng đột biến và nhóm đối chứng và nhóm đối chứng
Kết quả trên hình cho thấy: rõ ràng, ngay ở các cá thể đối chứng đã có sự khác biệt di truyền nhưng rất nhỏ và điều này là hoàn toàn dễ hiểu do vật liệu chúng tôi sử dụng khi xử lý là protocorm phát triển từ hạt và do vậy có sự phân
ly về kiểu gen. Sự khác biệt rất nhỏ về kiểu gen với các cây đối chứng có thể giải thích là do cây D. chrysotoxum đã được biết đến là cây ưa thích tự thụ hơn so với giao phấn chính vì vậy sự khác biệt về di truyền sẽ ít so với các giống lan khác (Ramawat et al., 2014). Điều thú vị là sự khác biệt di truyền là rất rõ ràng giữa cá thể đối chứng và cá thể đột biến khi các cá thể đối chứng và các cá thể đột biến được xếp vào hai nhóm khác biệt có ý nghĩa thống kê (được biểu thị bởi hai nhóm có màu khác biệt). Kết quả trên chứng tỏ các cá thể đột biến biểu hiện qua kiểu hình đều là những cá thể bị đột biến gen.
4.2. THẢO LUẬN
Nội dung 1. Xác định được kỹ thuật xử lý tạo đột biến phù hợp, đánh giá khả năng duy trì biến dị trong giai đoạn ni cấy in vitro
Đến nay, trên thế giới cũng chưa có nhiều báo cáo về việc tạo đột biết trên
cây Dendrobium chrysotoxum. Một số loài lan thuộc chi Dendrobium được
nghiên cứu tạo đột biến bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Trong nghiên cứu này, kết quả khi sử dụng sodium azide nồng độ 0,5 mM trong 30 phút để gây đột biến các chồi lan Dendrobium chrysotoxum đã cho tỷ lệ tạo đột biến cao nhất. Khi sử dụng nồng độ chất tạo đột biến cao và xử lí trong thời gian dài thì khả năng phát triển của chồi có xu hướng giảm đi. Kết quả này cũng được chỉ ra khi Wannajindaporn et al. (2016) nghiên cứu tạo đột biến trên
PLB cây Dendrobium ‘Earsakul’ bằng sodium azide. Khi sử dụng nồng độ 0,1
mM sau 2 tuần nuôi cấy 30% PLB bị chết, khi tăng lên 0,5 mM tỷ lệ chết là 50%. Khosravi et al. (2009) tiến hành nghiên cứu xử lý đột biến Dendrobium Serdang beauty bằng colchicine ở các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25 mg/l, kết quả khi sử dụng nồng độ colchicine là 25 mg/l thì tỷ lệ tạo đột biến cao nhất (đạt 26%), tuy nhiên các chồi này có trọng lượng tươi giảm rõ rệt so với các công thức sử dụng nồng độ thấp hơn. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD cho thấy cây đột biến tạo được từ việc xử lý đột biến bằng 25 mg/l colchicine phát hiện đa hình cao hơn các cây đột biến tạo được bằng các nồng độ khác và tính đa hình cũng rất cao so với 13 lồi khác trong chi Dendrobium. Ariffin (2000) đã sử dụng vật liệu là PLB của Dendrobium Sonia Kai để xử lí đột biến bằng cách chiếu xạ ở 35 Gy4 sau đó ni cấy các PLB này trên môi trường MS. Các cây đột biến thu được sau