GT TT dược LIỆU 1

Giáo trình Thực tập dược liệu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO KHOA DƯỢC GIÁO TRÌNH THỰC TẬP DƯỢC LIỆU (Dành cho sinh viên dược) ĐÀ NẴNG 01/2018 Giáo trình Thực tập dược liệu NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM Sự an tồn phịng thí nghiệm vấn đề đặt lên hàng đầu Vì vậy, tất sinh viên thực hành phịng thí nghiệm cán giảng dạy, cán làm công tác nghiên cứu phịng thí nghiệm phải thực theo nội quy sau: 1.Đọc kỹ tài liệu thực tập, nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phương pháp thực hành tập trước bước vào phịng thí nghiệm thực theo nội quy phịng thí nghiệm q trình thực tập, nghiên cứu 2.Mặc áo blouse suốt thời gian thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Chỉ mang tài liệu tối thiểu cần thiết cho thực tập vào chỗ làm, tất vật dụng khác phải để vị trí cách ly riêng 3.Khơng ăn uống, hút thuốc, trang điểm, nghe nhạc, đùa giởn phịng thí nghịêm 4.Phải vệ sinh thật vị trí thực tập, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm trước sau thực tập, nghiên cứu 5.Đổ hoá chất ngồi phải lau ngay, chai hố chất phải có tên hố chất Tuyệt đối khơng dùng dụng cụ lấy lúc nhiều loại hoá chất 6.Cấm tuyệt đối khơng dùng miệng để hút hố chất, khơng dùng mũi ngửi hố chất Pha dung mơi chất độc hại tủ hút khí độc có mang trang găng tay chống khí độc Đeo kính bảo hộ thực phản ứng, phản ứng với dung môi độc acid đậm đặc phải thực tủ hút Không hút thuốc dùng lửa trần phịng thí nghiệm khu vực lân cận 9.Tuân thủ nghiêm túc hướng dẫn cán phụ trách phịng thí nghiệm việc sử dụng hố chất, dụng cụ thiết bị Nếu có trường hợp xảy tai nạn, cố phải báo cho cán phụ trách để có biện pháp xử lý kịp thời VÌ AN TỒN CHO CÁ NHÂN BẠN VÀ MỌI NGƯỜI, HÃY TUÂN THỦ ĐÚNG QUY ĐỊNH Giáo trình Thực tập dược liệu CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CHUNG BÀI XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM VÀ CÁC CHẤT CHIẾT ĐƯỢC TRONG DƯỢC LIỆU Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Xác định độ ẩm dược liệu phương pháp sấy phương pháp chưng cất với dung môi - Xác định hàm lượng chất chiết dược liệu I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Định lượng độ ẩm dược liệu Tất dược liệu, điều kiện bảo quản bình thường, có chứa lượng nước đinh Tỉ lệ phần trăm lượng nước dược liệu gọi độ ẩm(hay thủy phần) dược liệu Muốn bảo quản dược liệu, tránh tượng lên meo mốc, hoạt chất dược liệu bị biến đổi dược liệu phải có độ ẩm khơng q giới hạn (được gọi độ ẩm an toàn) Với đa số dược liệu, độ ẩm an toàn khoảng 13% Định lượng độ ẩm dược liệu xác định tỉ lệ phần trăm nước dược liệu nhằm kiểm tra xem dược liệu có đạt tiêu chuẩn độ ẩm hay khơng Ngoài ra, xác định độ ẩm cần thiết việc tính tốn kết định lượng hay hiệu suất chiết hoạt chất dược liệu Có thể xác định độ ẩm phương pháp: Phương pháp sấy Là phương pháp loại nước khỏi dược liệu cách làm cho nước bay điều kiện nhiệt độ áp suất định Thông thường, nước tách khỏi dược liệu cách sấy 105oC áp suất thường Thực nghiệm tiến hành tủ sấy hay số thiết bị đặc biệt gọi cân xác định độ ẩm Phương pháp áp dụng với đa số dược liệu; nhiên khơng phù hợp với số dược liệu, ví dụ dược liệu có chứa tinh dầu, sấy nước tinh dầu bay dẫn tới khơng xác định xác lượng nước dược liệu Giáo trình Thực tập dược liệu Với dược liệu quý dược liệu có hoạt chất dễ bị phân hủy hay dễ chảy dính nhiệt độ cao (các dược liệu có nhiều đường tinh bột) người ta sấy nhiệt độ thấp áp suất giảm dùng chất hút ẩm kết hợp cách Để thực phương pháp sấy, người ta dùng tủ sấy cân xác định độ ẩm tia hồng ngoại Phương pháp cất với dung môi Trong phương pháp này, nước tách khỏi dược liệu cách cất lôi với dung môi chọn lọc Phương pháp áp dụng cho dược liệu, kể dược liệu có chất bay tinh dầu Thực nghiệm tiến hành dụng cụ đặc biệt gọi dụng cụ xác định độ ẩm Xác định chất chiết dược liệu (DĐVN IV, PL 12.10; PL239) Chất chiết dược liệu dung mơi chất hịa tan dung mơi tách khỏi dược liệu điều kiện quy định Chất chiết không thiết phải hoạt chất dược liệu, thơng thường gồm tất chất (hoạt chất chất khác) tan dung môi sử dụng Tùy theo dung môi mà thành phần chất chiết thay đổi dẫn tới thay đổi kết định lượng Định lượng chất chiết dược liệu xác định hàm lượng phần trăm chất chiết dược liệu điều kiện quy định; thường áp dụng cho dược liệu chưa có phương pháp định lượng hóa học hay sinh học thích hợp Dung mơi dùng xác định hàm lượng chất chiết thường nước cồn Các dung môi khác ether, cloroform đơi sử dụng Có phương pháp chiết sử dụng là: Phương pháp chiết nóng: Được áp dụng với chất khó tan dung mơi nhiệt độ thường, tan tốt dung môi nóng trường hợp dùng dung mơi nước hay cồn thấp độ Chiết nhiệt độ cao thường tạo nên dung dịch nhớt, khó lọc Phương pháp chiết lạnh: Được áp dụng cho chất dễ tan dung mơi nhiệt độ thường hay dược liệu có nhiều carbohydrat Tùy trường hợp mà Dược điển quy định sử dụng phương pháp chiết thích hợp Giáo trình Thực tập dược liệu II THỰC HÀNH Định lượng độ ẩm dược liệu 1.1 Phương pháp sấy 1.1.1 Nguyên tắc Sấy lượng cân xác dược liệu nhiệt độ 105 oC khối lượng không đổi Cân mẫu thử sau sấy Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước sau sấy, tính độ ẩm dược liệu 1.1.2 Cách tiến hành 1.1.2.1 Phương pháp dùng tủ sấy Lấy bình thủy tinh hình trụ có nắp mài, sấy đến khối lượng khơng đổi 105 oC Cân vào bình lượng xác khoảng 2-5g dược liệu đem sấy tủ sấy nhiệt độ 105oC 2-3 Dùng kẹp lấy bình hình trụ ra, để vào bình hút ẩm, mở khóa mở nắp bình hút ẩm cho thơng khí với bên ngồi khoảng phút đóng kín bình hút ẩm Để nguội bình hút ẩm 15 phút Cân ghi kết Tiếp tục sấy giờ, để nguội cân mẫu kết lần cân liên tiếp chênh lệch không 5mg Tính kết quả: Độ ẩm tính theo cơng thức X: độ ẩm dược liệu, tính phần trăm a: khối lượng dược liệu chưa sấy (g) b: khối lượng dược liệu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) 1.1.2.2 Phương pháp dùng cân xác định độ ẩm Trải mỏng khoảng 1,5g dược liệu nghiền mịn lên dĩa cân tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng máy Đọc kết Sau kết thúc thực nghiệm, phải để máy nguội khoảng 10 phút thực mẫu 1.2.Phương pháp chưng cất với dung môi (phương pháp thể tích) 1.2.1 Nguyên tắc Cất dược liệu với dung môi không đồng tan với nước tạo với nước thành hỗn hợp có điểm sơi định (hỗn hợp đẳng phí) Giáo trình Thực tập dược liệu Tại điểm sôi này, nước dung môi bốc Khi gặp lạnh ống sinh hàn, nước dung môi ngưng tụ lại rơi xuống ống hứng, nước tách khỏi dung môi Nước nặng dung mơi nên chìm xuống phần ống đo nước Cất đến thể tích nước khơng đổi Đọc thể tích nước Tính kết Dung mơi thường dùng là: toluen (điểm sôi 112 oC),xylen (hỗn hợp đồng phân có điểm sơi 136-140oC), benzen (điểm sơi 80oC) 1.2.2 Dụng cụ Bộ dụng cụ (xem hình vẽ) gồm: - Bình cầu (A) dung tích 500 ml - Ống dẫn (D) - Ống sinh hàn (C) - Bầu ngưng tụ (B) - Ống hứng (E) có dung tích 5-10 ml khắc vạch tới 1/10ml 1.2.3 Cách tiến hành Cho khoảng 250 ml dung môi (toluen, xylen) 2ml nước vào bình cầu A, lắp dụng cụ cất khoảng Để nguội 30 phút đọc thể tích nước (V) ống hứng E xác tới 0,05 ml Trong bình cầu A lúc dung mơi bão hịa nước điều kiện thí nghiệm Cân xác (với độ xác 0,01 g) lượng dược liệu dự đốn giải phóng khoảng 2-3ml nước (thơng thường khoảng 20-25 g dược liệu khơ) vào bình cầu A có dung mơi bão hòa nước Thêm vài hạt đá bọt vào bình cầu Đun nhẹ bình cầu 15 phút Khi hỗn hợp bắt đầu sôi, điều chỉnh nhiệt độ cho hứng khoảng giọt/ giây hầu cất hết tăng tốc độ cất lên giọt/ giây mực nước ống hứng E không thay đổi Dùng ml dung mơi tráng lịng ống sinh hàn cất tiếp phút ngưng cất Để nguội ống hứng E nhiệt độ phòng (nếu có giọt nước bám ống hứng, dùng đũa thủy tinh đẩy xuống lớp nước phía dưới) đọc thể tích nước (V1) Giáo trình Thực tập dược liệu Độ ẩm tính theo cơng thức X: độ ẩm dược liệu tính theo phần trăm V: thể tích nước cất lần tính ml V1: thể tích nước cất lần tính ml a: khối lượng dược liệu đem thử, tính gam 1.3 Nội dung thực hành Định lượng độ ẩm Trà phương pháp sấy Định lượng chất chiết dược liệu 2.1 Phương pháp tiến hành 2.1.1 Phương pháp chiết nóng Cân xác khoảng 2g dược liệu khô xay tới bột thô vào erlen 250ml có nút mài Thêm xác 50ml dung mơi, đậy nút cân xác tới 0,01g Lắc để yên Lắp sinh hàn hồi lưu vào bình đun sơi nhẹ Để nguội cân, điều chình khối lượng bình tới khối lượng ban đầu dung môi Lắc lọc nhanh hỗn hợp qua giấy lọc khô (không thấm dung mơi) Lấy xác 25ml dịch lọc vào bercher 50ml (đã cân bì) Cơ dịch lọc bếp cách thủy chén kết tinh (đã sấy khơ tới khối lượng khơng đổi cân bì) cắn khô Tiếp tục sấy cắn 100-105 oC Dùng kẹp lấy chén kết tinh ra, để nguội bình hút ẩm cân Hàm lượng % chất chiết tính cơng thức: a: khối lượng dược liệu đem thử (g) b: khối lượng cắn cân (g) h: độ ẩm (%) dược liệu 2.1.2 Phương pháp chiết nguội Giáo trình Thực tập dược liệu Cân xác khoảng 2g dược liệu khô xay thành bột nửa vào erlen 250ml có nút mài Thêm xác 50ml dung mơi, đậy nút, lắc 30 phút Để yên nhiệt độ phòng 18 Lắc hỗn hợp lọc nhanh qua giấy lọc khô, tránh bay dung mơi Lấy xác 25ml dịch lọc vào becher 50ml Cô dịch lọc bếp cách thủy chén kết tinh (đã sấy khơ tới khối lượng khơng đổi cân bì) cắn khô Tiếp tục sấy cắn 100-105oC Dùng kẹp lấy chén kết tinh ra, để nguội bình hút ẩm cân Tính hàm lượng % chất chiết phương pháp chiết nóng 2.2 Nội dung thực hành Tiến hành định lượng chất chiết Kim ngân hoa phương pháp chiết nóng với dung môi cồn 95% III GỢI Ý THẢO LUẬN Phương pháp sấy 1050C thường áp dụng dược liệu nào? Phương pháp không thích hợp trường hợp nào? Vì phương pháp áp dụng độ ẩm với dung môi áp dụng trường hợp dược liệu có tinh dầu (mặc dù tinh dầu bị cất khỏi dược liệu? Ý nghĩa việc xác định chất chiết dược liệu? Giáo trình Thực tập dược liệu BÀI NHẬN THỨC BỘT DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Thực tiêu bột dược liệu đạt yêu cầu, quan sát bột dược liệu kính hiển vi - Tìm vẽ phần tử đặc trưng bột dược liệu, xác định bột dược liệu, độ tinh khiết giả mạo có dược liệu học I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Mỗi dược liệu có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng thể phần qua đặc điểm bột dược liệu Những đặc điểm dùng để phân biệt dược liệu với dược liệu khác, để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Khảo sát bột dược liệu kính hiển vi tìm đặc điểm vi học đặc trưng bột dược liệu, giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết dược liệu, phân biệt với dược liệu dễ bị nhầm lẫn phát giả mạo có - Bột thường có màu xanh lục tới nâu Các cấu tử thường thấy là: biểu bì mang khí khổng, lơng che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, mạch gỗ… - Bột vỏ thân, vỏ rễ thường có màu vàng nâu tới nâu Các cấu tử thường thấy là: mảnh bần, mô mềm, loại sợi (vách dày hay mỏng, khoang rộng hay hẹp), tinh thể calci oxalat hay calci carbonat (với hình dạng khác nhau), mơ cứng Mơ mềm chứa tinh bột, ống nhựa mủ… gặp số dược liệu - Dược liệu cành hay tồn rễ ngồi đặc điểm vỏ cịn thấy loại mạch gỗ mơ gỗ - Các loại rễ củ, thân ngầm phình thành củ cần ý tới đặc điểm cấu tạo hạt tinh bột (hình dạng, kích thước, vân, tễ…) - Bột hoa, quả, hạt có màu sắc thay đổi tùy theo dược liệu - Các dược liệu hoa, cần ý cấu tạo hình dạng hạt phấn, biểu bì loại lơng che chở, lơng tiết bao hoa Giáo trình Thực tập dược liệu - Các dược liệu hạt cần ý biểu bì, mơ chứa chất dự trữ (carbohydrat hay dầu béo), phôi Khi khảo sát vi học dược liệu mới, để xác định cấu tử có dược liệu thuộc phận nào, loại mô nào… thường cần kết hợp so sánh với việc khảo sát riêng rẽ phận dược liệu Ví dụ, cần xác định cấu tử bột dược liệu biểu bì, cánh hoa phải so sánh với mảnh biểu bì quan sát bột từ cánh hoa tách riêng Trong nhiều trường hợp, dùng trực tiếp bột dược liệu chưa xử lý để quan sát thành phần bột Tuy nhiên có trường hợp bột cần xử lý để tiêu sáng, dễ quan sát Soi thường Soi thường phương pháp thường dùng Bột dược liệu phân tán nước cất Đối với tinh bột dược liệu có nhiều tinh bột (như hạt, củ - bột thường có màu trắng ngà), để quan sát cấu trúc hạt tinh bột giảm bớt ánh sáng Nếu khơng thấy rõ vân tễ, thêm giọt dung dịch KOH 5% mép lamelle quan sát ngay, dung dịch KOH khuếch tán vào bột làm cho vân tễ hạt tinh bột rõ Ngoài ra, dùng phương pháp làm sáng phương pháp nhuộm để quan sát dễ Phương pháp làm sáng Phương pháp thực cần tìm phần tử bột bị che lấp soi thường Có thể chọn cách sau: - Lấy bột đun sơi vài phút dung dịch NaOH 5% dung dịch KOH 5%, để nguội Soi kiềm rửa nước soi dung dịch glycerin - Ngâm bột nước Javel 50%, khuấy Thay dung dịch đến bột màu, rửa nhiều lần nước cất - Dược liệu có nhiều tinh bột (hạt, củ) làm sáng bột sau: Lấy bột đun nhẹ dung dịch cloral hydrat 50% vài phút Soi dung dịch cloral hydrat Đối với bột không thân nước, dùng hỗn hợp cloral hydrat với tỉ lệ 1:2 ngâm 15 phút đun sôi - Dược liệu có nhiều chất béo (quả hạt) loại chất béo làm sáng sau: lấy bột đun sơi acid nitric lỗng phút Lọc, rửa cắn với nước sôi Đun sôi cắn phút dung dịch kiềm Lọc rửa cắn với nước sôi Soi glycerin Phương pháp nhuộm - Để phân biệt màng tế bào cellulose hay tẩm lignin ( hóa gỗ ), bột đươc nhuộm kép dung dịch carmin % lục iod 0,1% (hoặc 10 Giáo trình Thực tập dược liệu ml Rửa phễu ether (TT) thêm ether (TT) tới vạch Lấy xác 10 ml dịch chiết ether cho vào cốc có mỏ dung tích 50 ml bốc đến cắn Hoà tan cắn với 10 ml dung dịch magnesi acetat 0,5% methanol (TT), đo độ hấp thu bước sóng 515 nm với mẫu trắng methanol (Phụ lục 4.1) Hàm lượng phần trăm dẫn chất hydroxyanthracen tính theo rhein tính theo cơng thức: X : Hàm lượng dẫn chất hydroxyanthracen A : Độ hấp thụ bước sóng 515 nm m : Lượng dược liệu tính gam (g) h: độ ẩm (%) dược liệu Dược liệu phải chứa 2,2% dẫn chất hydroxyanthracen tính theo rhein 40 Giáo trình Thực tập dược liệu BÀI DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Chiết xuất flavonoid từ dược liệu cho định tính - Thực phản ứng hóa học nhận định kết phản ứng định tính flavonoid từ dịch chiết dược liệu I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Flavonoid hợp chất có khung C6-C3-C6 với C6 vịng thơm (A B) O A B C O Vị trí 3, 5, 7, 3’, 4’, 5’ nhân thơm thường có nhóm –OH Mạch carbon thường tạo dị vòng oxy hay cạnh (C) Việc định tính flavonoid chủ yếu dựa vào phản ứng nhóm –OH phenol dị vịng C - Flavon, flavanon dẫn chất 3-hydroxy Phản ứng vòng γ-pyron Dưới tác dụng tác nhân khử (Mg/HCl; Zn/HCl; NaBH 4…) vòng γ-pyron flavon(ol), flavanon(ol) bị khử thành nhân pyrilium (tạo thành dẫn chất anthocyanidin tương ứng) làm cho dung dịch chuyển thành màu đỏ cam tới đỏ (phản ứng cyanidin, phản ứng Shibata…) Các chalcon môi trường acid trở thành flavanon nên dương tính với phản ứng Phản ứng –OH phenol 41 Giáo trình Thực tập dược liệu Các nhóm –OH phenol phân tử flavonid tạo phenolat với chất kiềm làm dung dịch tăng màu môi trường kiềm; tạo phức với ion kim loại đa hóa trị Fe3+, Cr2+, Pb2+, Zr2+… cho phức chất có màu và/hoặc kết tủa Các tính chất ứng dụng định tính chung polyphenol Trong mơi trường kiềm nhẹ, flavonoid có vịng thơm mà vị trí orthor hay para (so với nhóm –OH phenol) khơng có nhóm không bị cản trở lập thể se tạo với thuốc thử diazonium sản phẩm cộng hợp azoic có màu từ đỏ cam đến đỏ - Anthocyanin (AC) Do có nhân pyrilium, anthocyanidin có màu thay đổi tùy pH mơi trường Trong mơi trường acid, trung tính kiềm, c ác anthocyanidin cho màu đỏ, tím xanh Khi thực phản ứng cyanidin (Mg + HCl), AC cho màu đỏ (do môi trường có tính acid; khơng phải AC bị khử hóa tiếp tục) - Leucoanthocyanidin (LAC) Trong mơi trường acid đun nóng, LAC khơng màu bị oxy hóa phần thành dẫn chất AC tương ứng có màu đỏ cam tới đỏ Khi kiềm hóa dung dịch sau đó, dung dịch chuyển thành màu xanh II THỰC HÀNH - Dụng cụ, hóa chất, thuốc thử Cồn 25%, 96% Bột Mg kim loại Dung dịch HCl 1% HCl đậm đặc Dung dịch FeCl31% Dung dịch AlCl3 1% MeOH Dung dịch chì acetat trugn tính 1% Dung dịch Na2CO3 10% Dung dịch NaOH 1% Thuốc thử diazonium Dược liệu Nụ hoa hòe ( Styphnolobium japonicum (L.) Schott, Fabaceae) Vỏ bưởi (vỏ bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck, Rutaceae) Gỗ me (Tamarindus indica L., Fabaceae) Đậu đen (hạt đậu đen (Vigna unguiculata (L.) Walp., Fabaceae) Rễ tranh thân ngầm cỏ tranh (Imperata cylindrica (L.) P Beauv Poaceae) 42 Giáo trình Thực tập dược liệu Mẫu Dược liệu Thành phần định tính H Bột hoa Hịe Flavonol B Bột vỏ Bưởi Flavanon M Bột gỗ Me Đ Bột Đậu đen Anthocyanidin T Bột rễ Tranh Mẫu chứng khơng có flavonoid Leucoanthocyanidin Chiết xuất Lấy 0,5-1g dược liệu cho vào erlen 100ml (5 mẫu / erlen riêng biệt, có dán nhãn) Thên 25ml cồn 96% vào bình (riêng mẫu Đậu đen dùng cồn 25%) Đậy nút đun bếp cách thủy phút, lắc nhẹ Lọc nóng dịch chiết qua bơng, thu dịch lọc vào ống nghiệm (ghi tên mẫu) Các dịch chiết dùng để làm phản ứng hóa học giấy lọc ống nghiệm Định tính 3.1 Định tính giấy lọc Trên tờ giấy lọc 15x18 cm dùng bút chì kẻ thành bảng gồm hàng x cột.Mỗi hàng gồm ô ghi ô thử, cột gồm ô ghi ô thử tương ứng với loại dược liệu Trong hàng, dùng pipet Pasteur nhỏ thật gọn vào ô giọt dịch chiết loại dược liệu, để khô tự nhiên Lặp lại lần Vẽ vòng đánh dấu vết dịch chiết bút chì.Để định tính, cột số dùng để ghi tên mẫu, cột số dùng làm mẫu chứng (chỉ có dịch chiết, khơng có thuốc thử) 43 Giáo trình Thực tập dược liệu Mẫu thử Mẫu chứng NaOH 1% AlCl3 1% FeCl3 1% H B M Đ T Nhỏ riêng biệt lên cột lại loại thuốc thử dung dịch NaOH 1%, dung dịch AlCl3 1% MeOH dung dịch FeCl 1% Chú ý nhỏ dung dịch thuốc thử thành vòng bé, nằm gọn vết dịch chiết Để khô tự nhiên, quan sát màu ánh sáng thường đèn UV 365nm Ghi nhận màu sắc vết khơng có có thuốc thử, ánh sáng thường UV 365nm 3.2 Định tính ống nghiệm 3.2.1 Phản ứng nhóm –OH phenol nhân thơm Với dược liệu, lấy ống nghiệm, cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết để làm phản ứng sau: Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% Phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3 1% MeOH Phản ứng tạp phức với dung dịch FeCl3 1% Phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính Cách thực hiện: 1ml dịch chiết + 2-3 giọt thuốc thử, lắc đều, quan sát màu, tủa so sánh với mẫu chứng (riêng mẫu B, phản ứng với NaOH 1%; quan sát màu ống nghiệm trước sau nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút) 3.2.2 Phản ứng với thuốc thử diazonium 44 Giáo trình Thực tập dược liệu Thực hiện: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, kiềm hóa vài giọt dung dịch NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử diazonium lạnh Lắc quan sát màu dung dịch Ghi chú: thay NaOH 10% Na 2CO3 10% Chỉ dùng 1-2 giọt thuốc thử diazonium 3.2.3 Phản ứng vòng γ-pyron (Phản ứng Cyanidin) Cho 1ml dịch chiết mẫu H, B T vào ống nghiệm lớn riêng biệt có sẵn bột Mg kim loại Thêm từ từ thành ống nghiệm 0,5-1ml HCl đậm đặc (làm giá ống nghiệm đặt tủ hốt) Quan sát chuyển màu dung dịch Phản ứng nhóm anthocyanidin Cho vào ống nghiệm riêng biệt ống 1ml dịch chiết Đậu đen (Đ) Ống thứ thêm giọt HCl 1%, ống thứ thêm giọt NaOH 1%, ống thứ để nguyên Quan sát màu ống nghiệm 3.2.4 Phản ứng nhóm leucoanthocyanidin Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết gỗ Me (M) cồn giọt HCl đậm đặc Đun cách thủy vài phút, lắc Quan sát màu dung dịch, so với ống chứng Sau phản ứng, kiềm hóa mơi trường với giọt dung dịch NaOH 1% để xem chuyển màu dẫn chất anthocyanidin tạo thành 45 Giáo trình Thực tập dược liệu BÀI DƯỢC LIỆU CHỨA COUMARIN Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Chiết xuất coumarin từ dược liệu để dùng cho định tính - Thực phản ứng định tính coumarin dược liệu I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Coumarin hợp chất thuộc nhóm phenylpropanoid (C 6-C3) với khung benzo-α-pyron, với số tính chất sau: - Thường tồn dạng aglycon, dễ kết tinh, không màu, có mùi thơm đa số dễ thăng hoa - Ở dạng glycosid tan nước, dạng aglycon dễ tan dung mơi phân cực - Phát huỳnh quang UV 365nm, cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào nhóm oxy phân tử coumarin pH dung dịch, mạnh coumarin có nhóm –OH C7 (nhiều coumarin có -OH vị trí này) - Do có vịng lacton (ester nội) nên coumarin dễ bị mở vòng kiềm tạo thành muối tan nước, acid hóa thường có đóng vịng trở lại - Sau mở vòng lacton dung dịch kiềm, coumarin đơn giản tạo thành dẫn chất hydroxy cinnamic dạng cis (muối acid coumarinic), có huỳnh quang yếu UV 365nm Dưới tác dụng tia UV 365nm, chất chuyển thành dạng trans (muối acid coumaric), có huỳnh quang mạnh II THỰC HÀNH A Ngun vật liệu thí nghiệm Hóa chất, thuốc thử - Cồn 90% HCl đậm đặc Dung dịch KOH 5% methanol Dung dịch NaOH 5% Dung dịch NaOH 10% Dung dịch FeCl3 1% - Thuốc thử diazo - Than hoạt 46 Giáo trình Thực tập dược liệu - Dược liệu Lá ba dót ( Eupatorium triplinerve) Rễ củ bạch (Angelica dahurica ) Rễ tiền hồ (Peucedanum prearuptorum Dumn.) Rễ tranh (Imperata cylindrica) B Phương pháp tiến hành Chiết xuất - Phương pháp (áp dụng cho dược liệu thân, rễ) Lấy 1g bột dược liệu (Bạch chỉ, Tiền hồ…) cho vào erlen 100ml, thêm 20ml cồn 96% đun sôi cách thủy phút Lọc qua bông, thu dịch lọc để thực phản ứng định tính - Phương pháp (áp dụng cho dược liệu lá) Lấy 1g dược liệu (lá Ba dót) cho vào erlen 100ml, thêm 20ml cồn 96% đun sôi cách thủy phút Lọc qua bông, thu dịch lọc vào erlen khác Thêm vào dịch lọc khoảng than hoạt, lắc nhẹ đun cách thủy phút Lọc nóng qua giấy lọc, thu dịch lọc để thực phản ứng định tính Định tính coumarin phản ứng hóa học 3.1 Phản ứng với dung dịch FeCl3 Nhỏ vài giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc thành vịng trịn, chờ cho khơ dung mơi, nhỏ vào tâm vịng trịn 1-2 giọt dung dịch FeCl3 1% cho màu xanh (phản ứng dương tính coumarin có –OH phenol tự do) 3.2 Phản ứng đóng mở vịng lacton Cho vào ống nghiệm (kích thước 1,2 x 12 cm), ống 2ml dịch lọc: - Ống 1: thêm 4ml nước cất, dung dịch trở nên đục - Ống 2: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% (thường tăng màu vàng có coumarin) Đun cách thủy ống 2-3 phút Bổ sung nước vào ống thể tích ống Quan sát thấy ống ống Nếu tiếp tục acid hóa ống HCl đậm đặc thấy ống có độ đục gần Ghi chú: trường hợp kết khơng thấy rõ lấy ống (lúc đun với dung dịch kiềm chưa pha loãng) chia thành phần (2a 2b) vào ống nghiệm khác Acid hóa ống 2b với vài giọt HCl đậm đặc (thử giấy pH) thấy ống đục ống 2a 47 Giáo trình Thực tập dược liệu Chú ý: kích thước ống thể tích dung dịch ống nghiệm phải 3.3 Phản ứng với thuốc thử diazo Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, thêm 1ml dung dịch NaOH 5% Đun cách thủy phút để nguội làm lạnh vòi nước, thêm từ từ giọt thuốc thử diazo xuất màu đỏ đỏ cam Chú ý: - Phản ứng xảy pH kiềm yếu, kiểm tra pH dịch lọc trước làm phản ứng - Thuốc thử diazo pha dung dịch acid, cho nhiều thuốc thử dung dịch có pH acid phản ứng khơng xảy Thuốc thử diazo không bền nhiệt độ cao 3.4 Sự tăng huỳnh quang môi trường kiềm tác dụng tia UV Nhỏ giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, chờ khô dung môi lặp lại lần Nhỏ chồng lên giọt dung dịch NaOH 5%, sấy thật khô Che nửa vết dịch chiết miếng kim loại đem soi đèn UV 356nm 1-2 phút Lấy miếng kim loại thấy nửa không bị che phát quang sáng nửa bị che Nếu tiếp tục chiếu UV sau vài phút cường độ phát quang nửa Nên làm thêm mẫu chứng (chỉ có dịch chiết, sấy khơ) để so sánh Thử nghiệm vi thăng hoa Cho 1-2g bột dược liệu (Tiền hồ) vào chén nung nhỏ Đun cách cat, đảo cho cho bay hết nước đậy chén phiến kính có đặt sẵn miếng bơng gịn thấm nước lạnh, tiếp tục đun khoảng 5-10 phút (thỉnh thoảng thay lạnh) Lấy phiến kính ra, để nguội quan sát kính hiển vi (10x) thấy nhiều tinh thể hình kim khơng màu Nhỏ vài giọt cồn 96% lên phiến kính (lame) để hịa tan tinh thể này, chuyển dịch cồn vào ống nghiệm làm phản ứng với thuốc thử diazo để kiểm tra lại 48 Giáo trình Thực tập dược liệu BÀI DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Thực phản ứng định tính chung tanin dược liệu - Phân biệt loại tanin phản ứng hóa học - Định lượng tanin dược liệu phương pháp oxy hóa với KmnO4 I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Tanin (tannin, taninoid) hợp chất polyphenol phức tạp, có nguồn gơc thực vật, có vị chát có tính thuộc da Dựa vào cấu trúc hóa học, người ta xếp tanin vào nhóm chính: - Tanin thủy phân (tanin pyrogallic) - Tanin không thủy phân (tanin ngưng tụ, tanin pyrocatechic) Tanin dễ tan kiềm loãng, hỗn hợp cồn nước Tanin tan cồn, glycerin, propylen glycol, aceton ethyl acetat Tanin không tan dung môi phân cực Tanin tạo tủa với dung dịch nước protein Đây tính chất quan trọng để định tính tanin Để phân biệt loại tanin pyrogallic pyrocatechic dựa vào phản ứng phản ứng ngưng tụ nhân thơm tanin pyrocatechic tạpưo màu sắc khác hai loại tanin với thuốc thử FeCl 3, thuốc thử Stiassny, nước Brom… Có nhiều phương pháp định lượng tanin, phương pháp chuẩn độ thể tích, phương pháp đo màu… DĐVN IV quy định dùng phương pháp bột da để định lượng tanin dược liệu 49 Giáo trình Thực tập dược liệu II THỰC HÀNH A Ngun vật liệu thí nghiệm Hóa chất, thuốc thử - Dung dịch gelatin muối 1% - Thuốc thử stiasny - Dung dịch FeCl3 1% - Dung dịch chì acetat - Dung dịch KMnO4 0.1 N - Chỉ thị màu sulfo indigo - Nước brom Cách pha số thuốc thử 2.1 Dung dịch gelatin – muối Dung dịch gelatin 1% nước muối 10% 2.2 Thuốc thử Stiasny: Dung dịch formol – HCl đậm đặc (2:1), pha dùng 2.3 Chỉ thị sulfo indigo: Hòa tan g carmin indigo 25 ml acid sulfuric đậm đặc (TT) Thêm 25 ml acid sulfuric đậm đặc Sau pha vào nước đến vừa đủ 1000 ml Dược liệu - Ngũ bỗi tử - Lá ổi (Psidium guajava L., Myrtaceae) B Phương pháp tiến hành Chiết xuất Lấy 1g bột dược liệu cho vào erlen 50ml, thêm 30ml nước sôi, đun bế cách thủy sôi 10 phút, lắc đun Lọc nóng lấy dịch lọc Chiết tiếp bã dược liệu lần với 10ml nước, cần Dịch lọc thu dùng làm phản ứng định tính tanin Định tính chung tanin dược liệu 3.1 Phản ứng với dung dịch protein Lấy vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, cho vào giọt thuốc thử gelatin muối Phản ứng dương tính có tủa trắng đục 3.2 Phản ứng với muối kim loại nặng Cho vào ống nghiệm ống 2ml dịch chiết Thêm vào thuốc thử: - Ống 1: giọt TT FeCl3 1% - Ống 2: 1ml TT chì acetat 1% - Ống 3: giọt TT đồng acetat 1% 50 Giáo trình Thực tập dược liệu Quan sát màu, mức độ tạo màu, tạo tủa dược liệu Nếu cần pha loãng (nhỏ vài giọt sản phẩm vào ống nghiệm chứa 5ml nước) để quan sát cho rõ Định tính phân biệt loại tanin Cho vào ống nghiệm lớn ống 2ml dịch chiết Thêm vào thuốc thử: - Ống 1: giọt TT FeCl3 1% - Ống 2: 1ml TT Stiassny - Ống 3: giọt nước Brom Quan sát tạo màu, tạo tủa dung dịch để kết luận loại tanin Chú ý: pha lỗng vào nước để dễ quan sát Thuốc thử Tanin pyrogallic Tanin pyrocatechin FeCl3 1% → xanh đen → xanh rêu Stiassny + đun cách thủy 10 phút → không tủa → tủa vón, đỏ gạch Nước brom → khơng tủa → tủa ngà Xác đinh loại tanin dược liệu Lấy 5ml dịch chiết dược liệu có chứa loại tanin vào ống nghiệm lớn, thêm thuốc thử Stiasny, đun cách thủy 10 phút, lọc Dịch lọc tiếp tục với 1ml thuốc thử Stiassy mới: không cịn tủa ngưng; cịn tủa tiếp tục lọc lấy dịch lọc trong, tiến hành lặp lại khơng cịn tủa Lọc lấy dịch Trung hòa dịch lọc dung dịch NaOH 10% đến pH 5-6 tiếp tục thêm natri acetat (dung dịch đậm đặc hay tinh thể) pH trung tính kiềm nhẹ chia vào ống nghiệm, ống 2ml Thêm vào ống thứ vào giọt thuốc thử gelatin muối Thêm vào ống thứ hai giọt thuốc thử FeCl3 51 Giáo trình Thực tập dược liệu Quan sát: ống thứ có tủa trắng đục, ống thứ hai có màu xanh đen dược liệu có tanin pyrogallic Tìm catechin tự dược liệu Lấy 5ml dịch chiết dược liệu có chứa tanin catechic, thêm dung dịch gelatin muối, lọc lấy dịch Dịch lọc tiếp tục thêm gelatin muối, cịn tủa lọc tiếp đến dịch lọc khơng xuất thêm tủa với gelatin muối nữa, lọc lấy dịch Dịch lọc chia làm ống nghiệm, ống 2ml Ống thứ cho thêm giọt thuốc thử Stiassny, ống thứ hai thêm giọt thuốc thử FeCl3 Nếu ống thứ sau đun cách thủy 10 phút có tủa vón màu đỏ gạch ống thứ hai có màu xanh rêu dược liệu có catechin tự Định lượng tanin tự dược liệu 7.1 Nguyên tắc Tanin bị KMnO4 oxy hóa mơi trường acid Điểm kết thúc định lượng xác định thị màu sulfo indigo Từ lượng KmnO tiêu thụ, tính lượng chất bị oxy hóa dược liệu quy theo tanin chuẩn 7.2 Tiến hành Cân xác 1g bột Ổi (qua rây 0,5mm) cho vào erlen 250ml Thêm 50ml nước sôi đun cách thủy 30 phút, lắc Gạn lọc dịch lọc qua vào becher 250ml (tránh để mảnh dược liệu rơi lên bông) Tiếp tục chiết nhiều lần dịch chiết không cho phản ứng với thuốc thử FeCl3 1% (hoặc phèn sắt amoni) Làm nguội dịch chiết becher chuyển toàn dịch chiết (nhớ tráng becher) vào bình định mức 250ml thêm nước vừa đủ tới vạch Lấy 10ml dung dịch (pipet xác) cho vào erlen 1000ml, thêm 250ml nước 10ml (burette) dung dịch sulfo indigo (TT) Định lượng dung dịch KmnO4 0,1N chuyển sang màu vàng 1ml dung dịch KmnO4 0,1N tương ứng với 0,004157g tanin tinh khiết Song song định lượng mẫu trắng gồm 10ml dung dịch sulfo indigo 250ml nước Hàm lượng phần trăm tanin dược liệu (chưa trừ độ ẩm) tinh theo cơng thức 52 Giáo trình Thực tập dược liệu Công thức a: số ml dung dịch KMnO4 0,1N dùng cho mẫu thử b: số ml dung dịch KMnO4 0,1N dùng cho mẫu trắng 53 Giáo trình Thực tập dược liệu 54 ... 1. 1 .1 Nguyên tắc Sấy lượng cân xác dược liệu nhiệt độ 10 5 oC khối lượng không đổi Cân mẫu thử sau sấy Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước sau sấy, tính độ ẩm dược liệu 1. 1.2 Cách tiến hành 1. 1.2 .1. .. dược liệu đạt yêu cầu, quan sát bột dược liệu kính hiển vi - Tìm vẽ phần tử đặc trưng bột dược liệu, xác định bột dược liệu, độ tinh khiết giả mạo có dược liệu học I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Mỗi dược liệu. .. bước sóng 515 nm m : Lượng dược liệu tính gam (g) h: độ ẩm (%) dược liệu Dược liệu phải chứa 2,2% dẫn chất hydroxyanthracen tính theo rhein 40 Giáo trình Thực tập dược liệu BÀI DƯỢC LIỆU CHỨA