A. Nguyên vật liệu thí nghiệm
1. Dung môi, hóa chất và thuốc thử
- Cồn 25%, cồn 95% - CHCl3 - Dung dịch chì acetat 30% - Dung dịch natrisulfat 15% - Acid sulfuric đậm đặc - Anhydrid acetic
- Dung dịch NaOH 10% trong cồn. - Thuốc thử Xanthydrol
- Thuốc thử Keller – Kiliani - Thuốc thử Raymond – Marthoud - Thuốc thử Kedde
- Thuốc thử Legal - Thuốc thử Baljet.
2. Cách pha một số thuốc thử
Thuốc thử Xanthyldrol
Công thức 100 ml thuốc thử Xanthyldrol Xanthyldrol 10 mg
HCl đậm đặc 1ml
Acid acetic đậm đặc 99 ml
Cách pha:
Lấy 10mg xanthyldrol, hòa tan trong 99 ml acid acetic đậm đặc và thêm 1 ml HCl đậm đặc, trộn đều ( thuốc thử chỉ giữ 1-2 ngày, khi dùng mới pha).
2.1. Thuốc thử Keller – Kiliani
Dung dịch 1: 1 ml dung dịch FeCl3 5% trong 100 ml acid acetic đậm đặc. Dung dịch 2: 1 ml dung dịch FeCl3 5% trong 100 ml acid sulfuric đậm đặc.
2.2. Thuốc thử Balijet
Lấy 0.1 g acid picric hòa tan trong 25 ml cồn etylic 90%, cho thêm đủ 50 ml bằng một hỗn hợp gồm 5 g NaOH 15% và 70 ml nước, trộn đều (khi dùng mới pha).
Cũng có thể sử dụng thuốc thử pha theo cách sau: TT Baljet 1: dung dịch 0.2% acid picric trong cồn 90%. TT Bajet 2: dung dịch NaOH 1.5% trong nước.
Khi sử dụng pha đồng lượng thuốc thử Baljet 1 và Baljet 2.
Lưu ý: tất cả dụng cụ đều phải khô
3. Dược liệu
- Đay (Semen Corchori) là hạt cây Đay quả dài (Corchorus olitorius L., Tiliaceae)
B. Phương pháp tiến hành1. Chiết xuất glycosid tim 1. Chiết xuất glycosid tim
1.1. Từ lá Trúc đào
Lấy 5g bột lá Trúc đào ngâm trong một erlen 100ml với 30ml ethanol 25% trong 24 giờ. Sau đó đun nóng 5-10 phút (thỉnh thoảng lắc) trên bếp cách thủy sôi. Gạn hay lọc dịch lọc vào 1 becher.
Phần bã còn lại được chiết tiếp trên bếp cách thủy sôi như trên thêm 2 lần nữa, mỗi lần với 15ml ethenol 25%. Gộp chung các dịch lọc.
Thêm vào dịch chiết 6ml dung dịch chì acetat 30%, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc qua giấy lọc. Kiểm tra việc loại tạp bằng cách nhỏ thêm dung dịch chì acetat và lọc lại.
Thêm vào dịch lọc trên 6ml dung dịch natri sulfat 15%, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc lại qua giấy lọc. (Kiểm tra việc loại chì acetat bằng 1 giọt natri sulfat).
Dịch lọc sau khi đã loại hết muối chì thừa được lắc với CHCl3 (10ml x 2 lần) trong một bình lắng gạn. Gộp chung các dịch CHCl3 và làm khan bằng bột Na2SO4 khan. Chia dịch CHCl3 thành 6 phần (5 ống nghiệm và 1 chén sứ). Bốc hơi CHCl3 trong 4 ống nghiệm trên cách thủy cho đến cắn khô (thực hiện trong tủ hốt). Dịch CHCl3
trong ống nghiệm thứ 5 được dùng ngay để làm phản ứng Liebermann-Burchard. Dịch CHCl3 trong chén sứ được dùng để thực hiện phản ứng Raymond-Marthoud.
1.2. Từ hạt Đay
Lấy 5g bột hạt Đay cho vào erlen 100ml, thêm 30ml cồn 50%. Đun nóng trên bếp cách thủy trong khoảng 10-15 phút, thỉnh thoảng lắc đều. Để nguội và lọc dịch chiết qua bông vào một becher 100ml. Tiếp tục chiết như trên thêm 2 lần nữa, mỗi lần với 15ml cồn 50% và lọc nguội vào becher trên. Cô dịch lọc còn ½ thể tích.
Dịch cô được lắc với CHCl3 (15ml x 2 lần) trong bình lắng gạn và tiến hành tiếp (chia thành 6 phần…) như trong phần dịch CHCl3 chiết từ lá Trúc đào.
Phản ứng dương tính khi ở mặt ngăn cách của 2 lớp thuốc thử xuất hiện một vòng màu đỏ hoặc đỏ nâu và có màu xanh lá khuếch tán dần lên lớp trên.
2.1.2. Phản ứng với thuốc thử xanthydrol
Thêm 5ml thuốc thử xanthydrol (bằng pipet khô) vào 1 ống nghiệm khô có chứa cắn glycosid tim, khuấy kỹ cho tan cắn. Đậy ống nghiệm bằng nút bông rồi nhúng vào một becher chứa nước nóng trong 3 phút, thỉnh thoảng quan sát.
Phản ứng dương tính khi dung dịch có màu đỏ mận lan dần từ trên xuống.
2.2. Các phản ứng của phần aglycon2.2.1.Phản ứng của khung steroid 2.2.1.Phản ứng của khung steroid
Phản ứng Liebermann-Burchard
Cho 1ml anhydric acetic vào ống nghiệm khô có chứa sẵn 1ml dung dịch glycosid tim trong CHCl3, lắc đều.
Để ống nghiệm nghiêng vào giá hoặc 1 becher, cho nhẹ nhàng theo thành ống nghiệm khoảng 1ml acid sulfuric đậm đặc.
Phản ứng dương tính khi giữa 2 lớp thuốc thử xuất hiện 1 vòng ngăn cách, sát phía dưới vòng này có màu hồng hoặc tím, phía trên vòng này có màu xanh lá tới xanh chàm.
2.2.2. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
a. Phản ứng Baljet
Cho 1ml thuốc thử Baljet (dung dịch đồng lượng Baljet 1 + Baljet 2) vào 1 ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim rồi khuấy hay lắc kỹ.
Phản ứng dương tính khi dung dịch có màu đỏ cam đậm hơn so với ống chứng (chỉ chứaBaljet 1 + Baljet 2).
b. Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 3-4 giọt cồn 95% để hòa tan cắn.
Thêm vào đó 1-2 giọt dung dịch NaOH 10% trong cồn (hoặc pyridin), thêm tiếp dung dịch natri nitroprussiat 0,5%. Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ cam.
So sánh màu với ống chứng chứa thuốc thử.
c. Phản ứng Raymond-Marthoud
Cô chén sứ có chứa dịch glycosid tim trong CHCl3 đến khô, thêm vào chén 0,5ml thuốc thử meta-dinitrobenzen 1% trong cồn tuyệt đối, khuấy đều rồi thêm nhẹ nhàng theo thành chén sứ 1-2 giọt NaOH 10% trong cồn.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím không bền chuyển dần sang xanh dương.
Phản ứng này cũng có thể thực hiện trong ống nghiệm hay trên giấy lọc