II. THỰC HÀNH 1 Dụng cụ, hóa chất, thuốc thử
3. Định tính coumarin bằng phản ứng hóa học
3.1. Phản ứng với dung dịch FeCl3
Nhỏ vài giọt dịch lọc lên 1 tờ giấy lọc thành 1 vòng tròn, chờ cho khô dung môi, nhỏ vào tâm vòng tròn 1-2 giọt dung dịch FeCl3 1% sẽ cho 1 màu xanh (phản ứng dương tính nếu coumarin có –OH phenol tự do).
3.2. Phản ứng đóng mở vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau (kích thước 1,2 x 12 cm), mỗi ống 2ml dịch lọc: - Ống 1: thêm 4ml nước cất, dung dịch trở nên đục.
- Ống 2: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% (thường tăng màu vàng nếu có coumarin). Đun cách thủy ống 2 trong 2-3 phút. Bổ sung nước vào ống 2 cho đến thể tích bằng ống 1.
Quan sát sẽ thấy ống 2 trong hơn ống 1. Nếu tiếp tục acid hóa ống 2 bằng HCl đậm đặc sẽ thấy 2 ống có độ đục gần như nhau.
Ghi chú: trong trường hợp kết quả trên không thấy rõ thì có thể lấy ống 2 (lúc đã đun với
dung dịch kiềm nhưng chưa pha loãng) chia thành 2 phần đều nhau (2a và 2b) vào 2 ống
Chú ý: kích thước ống và thể tích dung dịch ở 2 ống nghiệm phải luôn như nhau.
3.3. Phản ứng với thuốc thử diazo
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, thêm 1ml dung dịch NaOH 5%. Đun cách thủy trong 2 phút rồi để nguội hoặc làm lạnh bằng vòi nước, thêm từ từ từng giọt thuốc thử diazo cho đến khi xuất hiện màu đỏ hoặc đỏ cam.
Chú ý:
- Phản ứng xảy ra ở pH kiềm yếu, kiểm tra pH của dịch lọc trước khi làm phản ứng.
- Thuốc thử diazo được pha trong dung dịch acid, do đó nếu cho quá nhiều thuốc thử thì dung dịch sẽ có pH acid và phản ứng không xảy ra được. Thuốc thử diazo không bền ở nhiệt độ cao.
3.4. Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc, chờ khô dung môi và lặp lại như trên 4 lần nữa. Nhỏ chồng lên đó 1 giọt dung dịch NaOH 5%, sấy thật khô. Che nửa vết dịch chiết bằng 1 miếng kim loại rồi đem soi đèn UV 356nm trong 1-2 phút.
Lấy miếng kim loại ra sẽ thấy nửa không bị che phát quang sáng hơn nửa bị che. Nếu tiếp tục chiếu UV sau vài phút thì cường độ phát quang của 2 nửa sẽ như nhau. Nên làm thêm 1 mẫu chứng (chỉ có dịch chiết, sấy khô) để so sánh.
4. Thử nghiệm vi thăng hoa
Cho 1-2g bột dược liệu (Tiền hồ) vào 1 chén nung nhỏ. Đun cách cat, thỉnh thoảng đảo cho đều cho bay hết hơi nước rồi đậy chén bằng 1 phiến kính trên có đặt sẵn 1 miếng bông gòn thấm nước lạnh, tiếp tục đun khoảng 5-10 phút nữa (thỉnh thoảng thay bông lạnh). Lấy phiến kính ra, để nguội rồi quan sát dưới kính hiển vi (10x) sẽ thấy nhiều tinh thể hình kim không màu.
Nhỏ vài giọt cồn 96% lên phiến kính (lame) để hòa tan các tinh thể này, chuyển dịch cồn vào 1 ống nghiệm và làm phản ứng với thuốc thử diazo để kiểm tra lại.
BÀI 9