Bài giảng miễn dịch học thú y chương 6

(Veterinary Immunology ) CHƢƠNG PHẢN ỨNG GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ 1)      Sự kết hợp kháng nguyên khángthể Khi cho KT đặc hiệu tiếp xúc với KN kích thích sinh chúng thi phản ứng kết hợp KN + KT xảy cách đặc hiệu Phản ứng kết hợp xảy thể động vật hay ống nghiệm KT dịch thể đặc hiệu thường tồn huyết chất dịch thể, nên phản ứng kết hợp giua KN + KT dịch thể gọi phản ứng huyết học Phương pháp chẩn đoán dựa vào phản ứng huyết học gọi phương pháp chẩn đoán huyết học Phương pháp thường thực phịng thí nghiệm hay thể động vật Việc dùng phản ứng kết hợp giưa KN + KT đặc hiệu cho phép ta xác định KN chưa biết KT biết ngược lại 2) Phản ứng huyết học  Khi KN tiếp xúc với KT dịch thể đặc hiệu tương ứng phản ứng kết hợp giưa KN +KT xảy cách đặc hiệu  Cụ thể Epitop kết hợp xác với Paratop kháng thể  Sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể phải thực điều kiện định: nhiệt độ, pH thích hợp mơi trường có chất điện giải  Các phản ứng kháng nguyên kháng thể chia làm hai nhóm: 1- Những phản ứng quan sát trực tiếp mắt thường 2-Những phản ứng phải dùng kỹ thuật đánh dấu để phát PHẢN ỨNG GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ PHẢN ỨNG GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ Kết phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Miễn dịch huỳnh quang  Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp • Dùng kháng kháng thể nhuộm chất phát huỳnh quang để phát kháng ngun cần chẩn đốn • Phương pháp có thành phần tham gia phản ứng - Kháng nguyên cần chẩn đoán - Kháng thể đặc hiệu - Kháng kháng thể gắn chất phát huỳnh quang • Trong kháng thể đặc hiệu có chức năng: - Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán - Là kháng nguyên kháng kháng thể đánh dấu Cách làm: • Lấy bệnh phẩm cần chuẩn đoán làm tiêu để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính • Nhỏ giọt kháng thể đặc hiệu lên phiến kính Ủ 370C/1h, rửa nước • Nhỏ tiếp - giọt kháng kháng thể gắn chất phát huỳnh quang Ủ 370C/1h, rửa nước, để khô, quan sát kính hiển vi huỳnh quang Đọc kết - Phản ứng dương tính: Có tượng phát sáng, tức có tượng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể  gia súc mắc bệnh - Phản ứng âm tính: Khơng có tượng phát sáng, tức khơng có tượng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể Bởi kháng ngun kháng thể khơng tương ứng, khơng có kết hợp kháng ngun - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi Phƣơng pháp gián tiếp hay đƣợc sử dụng vì: - Chỉ cần lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta sử dụng để chẩn đoán nhiều kháng nguyên khác nhau, với điều kiện kháng thể đặc hiệu chúng phải chế loài vật - Độ nhạy phản ứng cao hơn, phân tử kháng nguyên bị nhiều kháng thể bám vào  độ phát quang tăng lên, dễ phát Kết phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp  Kỹ thuật Sandwich Immunofluorescence Assay ("Bánh mì kẹp chả")  Đây dạng cải biến miễn dịch huỳnh quang, dùng để phát tế bào tiết kháng thể  Cắt mảnh tổ chức dạng lympho, đặt mảnh tổ chức lên phiến kính  Lấy kháng nguyên phủ lên mảnh cắt Để thời gian, rửa nước, loại bỏ kháng nguyên chưa gắn với kháng thể đặc hiệu bề mặt tế bào lympho  Nhỏ tiếp kháng thể đặc hiệu gắn chất phát huỳnh quang, để thời gian, rửa nước, để khô, quan sát kính hiển vi huỳnh quang Đọc kết - Nếu có tượng phát sáng, chứng tỏ tế bào sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên  Phản ứng miễn dịch gắn enzim (Enzim linked Immuno Sorbent Assay - ELISA) Nguyên lý: Dùng kháng thể kháng kháng thể gắn enzim, cho kết hợp trực tiếp gián tiếp với kháng nguyên, sau cho chất đặc hiệu với enzim vào, chất kết hợp với enzim gắn tạo nên màu  Phản ứng ELISA trực tiếp: Dùng để chẩn đoán kháng nguyên - Cho kháng nguyên cần chẩn đốn vào (kháng ngun chiết xuất dạng hồ tan) để độ giờ, rửa nước (loại bỏ thành phần thừa) - Cho kháng thể đặc hiệu gắn enzim vào Để thời gian, rửa nước - Cho chất đặc hiệu với enzim vào, để thời gian (20 - 30') Đọc kết + Nếu có màu tức có kháng nguyên tương ứng với kháng thể đặc hiêu, phản ứng dương tính + Nếu khơng có màu: Phản ứng âm tính Phản ứng ELISA trực tiếp ELISA  Phản ứng ELISA gián tiếp: Dùng để phát kháng thể - Cho kháng nguyên biết hấp phụ lên nhựa, để thời gian (qua đêm), rửa nước để loại kháng nguyên thừa - Cho huyết cần chẩn đoán vào, ủ giờ/370C Rửa nước loại bỏ thành phần thừa - Cho kháng kháng thể tương ứng gắn enzim vào, ủ giờ/370C, rửa nước - Cho chất đặc hiệu với enzim vào, ủ giờ/370C, đọc kết Phản ứng dương tính: Có màu xuất So màu quang phổ kế để định lượng mức độ phản ứng Phản ứng âm tính: Khơng có màu xuất Trong phản ứng ELISA enzim có hoạt tính cao hay sử dụng peroxydase, chất dùng với enzim 3,3' diaminobenzidin, tác dụng enzim tạo màu nâu Phản ứng ELISA có độ nhậy cao Phản ứng ELISA gián tiếp  Phản ứng miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay) Dùng chất đánh dấu đồng vị phóng xạ I125, phát máy đếm gamma (máy đo đồng vị phóng xạ) • Ngun lý (giống nhƣ miễn dịch huỳnh quang) Khi dùng kháng thể kháng kháng thể gắn đồng vị phóng xạ, cho kết hợp với kháng nguyên cần chuẩn Nếu có phức hợp kháng nguyên - kháng thể, đo máy đo đồng vị phóng xạ có nhấp nháy Có phƣơng pháp: Trực tiếp gián tiếp Độ nhạy phản ứng cao Độ nhạy số phản ứng huyết học + Phản ứng kết tủa môi trường đặc, phát kháng nguyên nồng độ: g/ml + Phản ứng ngưng kết trực tiếp  0,5g/ml + Phản ứng ngưng kết gián tiếp  0,001 g/ml + Kết hợp bổ thể  0,1 g/ml + Miễn dịch huỳnh quang  0,1 g/ml + Miễn dịch enzim  0,00001 g/ml + Miễn dịch phóng xạ  0,000001 g/ml ... với huyết miễn dịch tả cịn tươi  có tượng tan vi khuẩn tả - Cho vi khuẩn tả kết hợp với huyết miễn dịch tả đun 560 /30'  vi khuẩn tả không bị tan - Cho vi khuẩn tả kết hợp với huyết miễn dịch. .. động vật hay ống nghiệm KT dịch thể đặc hiệu thường tồn huyết chất dịch thể, nên phản ứng kết hợp giua KN + KT dịch thể gọi phản ứng huyết học Phương pháp chẩn đoán dựa vào phản ứng huyết học gọi... chúng di chuyển gặp nhanh (1 - thay vi 24 - 48 giờ)  Phản ứng x? ?y nh? ?y (nhờ điện trường 90% kháng nguyên, kháng thể ngược chiều để gặp nhau, thay vi khuếch tán tứ phía có 25% gặp  Miễn dịch điện