Tối ưu hóa điều kiện nuôi agrobacterium tumefaciens sinh tổng hợp coenzyme q10 và xác định một số đặc tính

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LƯU HỒNG SƠN TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LƯU HỒNG SƠN TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS ĐẶNG THỊ THU HÀ NỘI – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trương Quốc Phong chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB Bộ cơng thương Trưởng phịng Proteomics trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực tập nghiên cứu hỗ trợ kinh phí để thực luận văn Xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm viện cơng nghệ sinh học cơng nghệ thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Nhân dịp xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ Viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, cũngchân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa, đồng nghiệp khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện tốt cho trình học tập Đại học Bách Khoa Hà Nội Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Lưu Hồng Sơn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp: “Tối ƣu hóa điều kiện ni Agrobacterium tumefaciens sinh tổng hợp coenzyme Q10 xác định số đặc tính” kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu đề tài“Nghiên cứu quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB Bộ Công thương, thực hướng dẫn khoa học GS.TS Đặng Thị Thutrường Đại học Bách Khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc Trung tâm Nghiên cứu Phát triển CNSH, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Lƣu Hồng Sơn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU TĨM TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1.Coenzyme Q10 1.1.1.Khái niệm 1.1.2.Cấu tạo 1.2 Đặc tính 1.2.1 Đặc tính lý hóa 1.2.1.1.Tình bền nhiệt CoQ10 1.2.1.2.Ảnh hưởng ánh sáng 1.2.2 Đặc tính sinh học 1.3 Nguồn thu CoQ10 1.4 Cơ chế sinh tổng CoQ10 10 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp CoQ10 14 1.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 14 1.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 14 1.5.3 Ảnh hưởng khoáng chất 15 1.5.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 15 1.5.5 Ảnh hưởng pH môi trường 15 1.5.6 Ảnh hưởng oxy hòa tan: 16 1.6 Các phương pháp tách chiết tinh CoQ10 16 1.7 Ứng dụng CoQ10 17 1.7.1 Ứng dụng y học 18 1.7.2 Ứng dụng thực phẩm chức 19 1.7.3 Trong mỹ phẩm 19 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Chủng vi sinh vật 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 21 2.1.4 Các môi trường sử dụng 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 23 2.2.1.1 Nuôi A.tumerfaciens tái tổ hợp phương pháp ni cấy chìm 23 2.2.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp CoQ10 trình lên men 23 2.2.2 Phương pháp hóa lý – hóa sinh 24 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết CoQ10 24 2.2.2.2 Xác định hàm lượng CoQ10 theo phương pháp caraven (1968) dựa phản ứng tạo màu ethyl cyanoacetate 25 2.2.3.Xác định hoạt tính chống oxy hóa cách loại bỏ gốc tự DPPH 26 2.2.4 Khảo sát đặc tính CoQ10 27 2.2.5 Kiểm tra, định lượng HPLC 28 2.2.6 Phương pháp toán học 29 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy 32 3.1.1 Khảo sát nguồn cacbon 32 3.1.2 Khảo sát nồng độ sucrose 33 3.1.3 Khảo sát nguồn nitơ 34 3.1.4 Khảo sát nồng độ dịch chiết cao ngô (CSL) 35 3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy 36 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đầu 36 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng giống 37 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 38 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian 38 3.3 Kết tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện nuôi cấy chủng A tumefaciens tái tổ hợp quy hoạch bậc Box-Behnken 39 3.4 Tách chiết CoQ10 43 3.4.1 Khảo sát phương pháp tách chiết 43 3.4.2 Kiểm tra tinh CoQ10 sau tách chiết HPLC 44 3.5 Khảo sát số đặc tính CoQ10 46 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền CoQ10 46 3.5.2.Khảo sát ảnh hưởng pH tới độ bền CoQ10 46 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng tới hoạt tính CoQ10 47 3.5.4 Khảo sát khả chống oxy hóa CoQ10 DPPH 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 56 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU TĨM TẮT Kí hiệu STT Tên ATP Adenosine triphosphate CoQ10 Coenzyme Q10 DPS Decaprenyl diphosphate synthase DXS 1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase DMAPP Dimethylallyl diphosphate EDTA Ethyldiamin tetraaxetic acid FPP Farnesyl phosphate IPP Isopentenyl diphosphate MEP 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate MVA Mevalonate 11 Phba p-hudroxybenzoic acid 12 CSL Corn steep Liquor 13 Da Dalton 14 Cfu Colony forming unit 15 CoQ Coenzyme Q 10 16 CoQ10 Coenzyme Q10 17 CoQ10H2 Coenzyme Q10quinol 18 HPLC High-performance liquid chromatography 19 DO Dissolved oxygen 20 CS Cộng 21 UVA bước sóng từ315 nm – 400 nm 22 DNA Deoxyribonucleic acid 23 OD Mật độ quang (độ hấp thụ) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Các trạng thái khác CoQ10 [17] Hình 1.2 Vị trí CoQ10 lớp kép lipid Hình 1.3 Sơ đồ sinh tổng hợp CoQ10 sinh vật [11] 10 Hình 1.4 CoQ10 làm giảm bề dày nếp nhăn vùng xung quanh mắt sau tháng sử dụng 20 Hình 2.1 Phản ứng ethyl cyanoacetate CoQ10 [5] 25 Hình 2.2 Phương trình phản ứng trung hịa gốc DPPH chất chống oxy hóa 26 Hình 2.3: Sơ đồ nguyên lý sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 28 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ cacbon đến khả sinh tổng hợp CoQ10 32 Hình 3.2 : Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả sinh tổng hợp CoQ10 33 Hình 3.3 : Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp CoQ10 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ bột chiết cao ngô đến khả sinh tổng hợp CoQ10 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đầu đến khả sinh tổng hợp CoQ10 36 Hình 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng giống đến khả sinh tổng hợp CoQ10 37 Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp CoQ10 38 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian lên men lên thâyrình sinh tổng hợp CoQ10 39 Hình 3.9 Bề mặt đáp ứng hàm lượng CoQ10 42 Hình 3.10 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A tumefaciens tái tổ hợp sinh CoQ10 43 Hình 3.11 Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10 44 Hình 3.12 Sắc ký đồ dịch chiết CoQ10 chuẩn (a) dịch chiết CoQ10sau tinh (b) 45 Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền CoQ10 46 Hình 3.14 Ảnh hưởng pH tới độ bền CoQ10 47 Hình 3.15 Ảnh hưởng ánh sáng tới hoạt tính CoQ10 47 Hình 3.16 Khả chống oxy hóa CoQ10 48 Hình 3.17 Kết khả chống oxy hóa CoQ10 49 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Khả hòa tan CoQ10 dung môi khác 200C[12] Bảng 1.2: Các gen mã hóa cho enzyme xúc tác tới trình tổng hợp CoQ10 13 Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng 22 Bảng 2.2: Các môi trường sử dụng trình nghiên cứu 23 Bảng 2.3: Các biến số khoảng chạy chúng 29 Bảng 2.4: Ma trận thực nghiệm 30 Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng CoQ10thu 40 Bảng 3.2 Phân tích phương sai ANOVA mơ hình 41 CoQ10giúp xác định công thức điều chế điều kiện bảo quản phù hợp Trong nghiên cứu độ bền CoQ10 xác định giá trị pH 5-9 Kết cho thấy CoQ10 tương đối bền dải pH 6-9 Độ bền tương đối đạt khoảng 95% sau 120 (hình 3.14) Tuy nhiên độ bền CoQ10 giảm điều kiện axit Hàm lượng CoQ10 giảm khoảng 18% sau 24 32% sau 120 120 Độ bền tương đối (%) 100 80 60 40 20 pH pH pH pH pH 0h 24h 48h 72h 96h 120h Thời gian (giờ) Hình 3.14 Ảnh hưởng pH tới độ bền CoQ10 3.5.3 Khảo sát ảnh hƣởng ánh sáng tới hoạt tính CoQ10 Để khảo sát ảnh hưởng ánh sáng tới hàm lượng CoQ10 CoQ10 giữ hai điều kiện khác giữ tối chiếu sáng liên tục Hàm lượng CoQ10 thay đổi xác định sau 24 144 Hình 3.15 Ảnh hưởng ánh sáng tới hoạt tính CoQ10 47 Khi để CoQ10 tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng phịng thí nghiệm liên tục sau 24 hàm lượng CoQ10 bị tổn thất 32% Thời gian tiếp xúc ánh sáng nhiều hàm lượng CoQ10 giảm Sau 144 bị tổn thất 72% Trong đó, mẫu bọc giấy bạc sau 144 hàm lượng CoQ10 giảm khơng đáng kể Ánh sáng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính CoQ10 Điều quan trọng, bảo quản CoQ10 cần tránh ánh sáng 3.5.4 Khảo sát khả chống oxy hóa CoQ10 DPPH Ngồi vai trị quan trọng việc sản sinh lượng, CoQ10còn chất chống oxy hóa tự nhiên tốt Hoạt tính chống oxy hóa CoQ10 xác định thơng qua làm giảm màu thuốc thử DPPH, xác định phép đo độ hấp thụ bước sóng 517 nm máy quang phổ Kết cho thấy CoQ10 nồng độ 0,18 mM có khả làm giảm 50% gốc tự 0,5 mM DPPH Hình 3.16 Khả chống oxy hóa CoQ10 48 Hình 3.17 Kết khả chống oxy hóa CoQ10 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau q trình tiến hành thí nghiệm, thu kết sau: Bước đầu khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp CoQ10 Dựa vào kết khảo sát để lựa chọn khoảng giá trị thích hợp biến thí nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp CoQ10 - Nguồn C: Sucrose 5% - Nguồn Nitơ: CSL 1% - Nhiệt độ 280C - pH - Tỷ lệ giống ban đầu (OD = 0,8) Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc Box-Behnken tìm điều kiện tối ưu nuôi chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợplà sucrose 5,17%, nồng độ dịch chiết cao ngô 0,86%, nhiệt độ 27,87 oC, pH 7, thời gian nuôi 96 Đã xác định số đặc tính CoQ10: CoQ10 bền với nhiệt độ từ – 600C, pH – 9, không bền có ánh sáng Có hoạt tính chống oxy hóa EC50 = 0,18 mM KIẾN NGHỊ - Tiến hành lên men qui mô pilot - Xác định tiếp số hoạt tính sinh học CoQ10 khả chống ung thư, HIV,… 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009), “Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm phân loại chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học, số 5, trang 8-14 Ngô Thị Xuyên, Lê Lương Tề, (2006), “Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensvà bệnh u sùi rễ hoa hồng số tình miền Bắc Việt Nam” Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội Tiếng Anh Arroyo, A.; Navarro, F.; Navas, P.; Villalba, J M (1998) "Ubiquinol regeneration by plasma membrane ubiquinone reductase" Protoplasma 205: 107-13 Battino, Maurizio; Ferri, Elida; Gorini, Antonella; Villa, Roberto Federico; Huertas, Jesus Francisco Rodriguez; Fiorella, Pierluigi; Genova, Maria Luisa; Lenaz, Giorgio; Marchetti, Mario (1990) "Natural Distribution and Occurrence of Coenzyme Q Homologues" Molecular Membrane Biology9 (3): 179–90 Elliot Redalieu, Inger M Nilsson, Thomas M Farley and Karl Folkers, 1968 Determination and Levels of Coenzyme Q10 in Human Blood Analytical Biochemistry23, 132-140 Frederick L Crane, PhD (2001) “Biochemical Functions of Coenzyme Q10” Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana Ha S.J., Kim S.Y., Seo J.H., Oh D.K., Lee J.K (2007), “Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens”, Appl Microbiol Biotechnol 74: pp 974-980 Hectors MPC, van Tits LJH, de Rijke YB, Demacker PNM (2003) “Stability studies of ubiquinol in plasma” Annals of Clinical Biochemistry ;40:100-1 51 Kaikkonen J, Nyyssönen K, Salonen JT (1999), “Measurement and stability of plasma reduced, oxidised and total coenzyme Q10 in humans”, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation ;59:457-66 10 Lang JK, Gohil K, Packer L (1986), “Simultaneous determination of tocopherols, ubiquinols, and ubiquinones in blood, plasma, tissue homogenates, and subcellular fractions”, Analytical Biochemistry ;157:106-16 11 Marimuthu Jeya, Hee-Jung Moon, Jeong-Lim Lee, In-Won Kim, Jung-Kul Lee, 2010 Current state of coenzyme Q10 production and its applications Appl Microbiol Biotechnol 85, 1653 - 1663 12 Monica Ondarroa, Santosh K Sharma and Peter J Quinn, 1986 Solvation Properties of Ubiquinone-10 in Solvents of different polarity Bioscience Reports, Vol.6, No.9 13 Narendra Kumar S*, Puspha Agrawal, Sujata AS and Bhavana BK (2012), “ Fermentation, media optimization studies for Coenzyme Q10 production by Saccharomyces cerevisiae”, International research journal of pharmacy ISSN 2230 – 8407 14 Papas AM (1999), “Other antioxidants” Antioxidant status, diet, nutrition, and health New York: CRC Press LLC p 231–48 15 Ranadive P., Mehta Alka., George Saji (2011) Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii-ATCC International Journal of Chemical Engineering and Applications, Vol 16 Sarah L Molyneux (2006), “Development of assays for Coenzyme Q10 and their application in clinical trials” A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University of Canterbury 17 Soo-Ryun Cheong, Sang-Young Kim, Jung-Kul, Hyeon-Cheol, Suk-Jin Ha (2008) “Fermentation process for preparing Coenzyme Q1o by the recombinant Agrobacterium Tumefaciens” Patent Application Publication 18 Tang PH, Miles, M.V., DeGrauw, A., Hershey, A., Pesce, A (2001) “HPLC analysis of reduced and oxidised coenzyme Q10 in human plasma” Clinical Chemistry;47:256-65 52 19 Tian Y (2010), “Improvement of cultivation medium for enhanced production of coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum”, Biochemical Engineering Journal 51, 160–166 20 Tian Y et al 2010; Effects of Cell Lysis Treatments on the Yield of Coenzyme Q10 Following Agrobacterium tumefaciens Fermentation; Food Sci Tech Int 2010;16(2):0195–9 21 University of Canterbury, 2006 Development of assays for Coenzyme Q10 and Vitamin K, and their application in clinical trials 22 Weber C, Bysted A, Holmer G (1997), “The coenzyme Q10 content of the average Danish diet” Int J Vit Nutr Res 67:123–9 23 Yoshida H., Kotani Y., (1998), “Production of ubiquinone-10 using bacteria” J Gen Appl Microbiol., 44, 19–26 (1998) 24 Yuan Y., Tian Y., Yue T (2012), “Improvement of Coenzyme Q10 Production: Mutagenesis Induced by High Hydrostatic Pressure Treatment and Optimization of Fermentation Conditions” Journal of Biomedicine and Biotechnology 25 Zahiri H.S., Yoon S.H., Keasling J.D(2006) Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway Metabolic Engineering 8, 406 – 416 26 Fir M.M., Smidovnik A., Milivojevic L., Zmitek J and Prosek M - Studies of CoQ10 and cyclodextrin complexes: solubility,thermo- and photo-stability Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 64 (2009) 225232 27 Michael R.S., (2010), “Coenzyme Q10 Biosynthesis in Plants” A dissertation submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 28 Orihara N, Kuzuyama T, Takahashi S, Furihata K, Seto H (1998), “Studies on the biosynthesis of terpenoid compounds produced by actinomycetes Biosynthesis of the isoprenoid side chain of novobiocin via the nonmevalonate pathway in Streptomyces niveus” J Antibiot (Tokyo) 51:676–678 53 29 Rohmer M, Seemann M, Horbach S, Bringer-Meyer S, Sahms H (1996), “Glyceraldehyde 3-phosphate and pyruvate as precursors of isoprenic units in an alternative non-mevalonate pathway for terpenoid biosynthesis” J Am Chem Soc 118:2564–2566 30 Yalcin A, Kilinc E, Sagcan A, Kultursay H (2004), “Coenzyme Q10 concentrations in coronary artery disease” Clin Biochem 37:706–9 31 Munkholm H, Hansen HHT, Rasmussen K (1999), “Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure” Biofactors 9:285–9 32 Langsjoen PH, Langsjoen AM (1999), “ Overview of the use of CoQ10 in cardiovascular disease”, Biofactors 9(2–4):273–84 33 Conklin KA (2000), “Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects”, Nutr Cancer 37(1):1–18 34 Xinyi Liu, Haizhen Wu, Jiang Ye, Qinsheng Yuan, and Huizhan Zhang (2011), “Cloning and characterization of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter capsulatus B10”, Can J Microbiol Vol 52, 2006 35 Park Y.C., Kim S.J., Choi J.H., Lee W.H., Park K.M., Kawamukai M., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), “Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans”, Appl Microbiol Biotechnol 67: pp 192–196 36 Hodges S, Hertz N, Lockwood K, Lister R (1999), “CoQ10: could it have a role in cancer management?” Biofactors 9:365–70 37 Langsjoen PH, Langsjoen AM (1999), “ Overview of the use of CoQ10 in cardiovascular disease”, Biofactors 9(2–4):273–84 38 T R Kommuru, B Gurley, M A Khan, I K Reddy, Int J.Pharm.2001, 212, 233–246 39 Maja Milivojevic Fir, Luka Milivojevic, Mirko Prosek and Andrej Smidovnik* (2009), Property Studies of Coenzyme Q10–Cyclodextrins complexes 54 40 Xia Q., and Wang H – Study on stability of Coenzyme Q10-loaded nanostructured lipid carriers, Integrated Ferroelectrics: An international Journal 129(1) (2011) 208-214 41 Hamano Y, Dairi T, Yamamoto M, Kuzuyama T, Itoh N, Seto H., (2002), “Growth-phase dependent expression of the mevalonate pathway in a terpenoid antibiotic-producing Streptomyces strain”, Biosci Biotechnol Biochem 66:808–819 42 Yalcin A, Kilinc E, Sagcan A, Kultursay H (2004), “Coenzyme Q10 concentrations in coronary artery disease” Clin Biochem 37:706–9 43 Munkholm H, Hansen HHT, Rasmussen K (1999), “Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure” Biofactors 9:285–9 44 Conklin KA (2000), “Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects”, Nutr Cancer 37(1):1–18 45 Park Y.C., Kim S.J., Choi J.H., Lee W.H., Park K.M., Kawamukai M., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), “Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans”, Appl Microbiol Biotechnol 67: pp 192–196 46 Ingram L.O – Mechanism of lysis of Escherichia coli by ethanol and other chaotropic agents, J Bacteriol Apr 146(1) (1981) 331 – 336 47 Cheng B., Yuan Q.P., Li W.J., (2010), “Enhanced Production of Coenzyme Q10 by Overexpressing HMG-CoA Reductase and Induction with Arachidonic Acid in Schizosaccharomyces pombe”, Appl Biochem Biotechnol 160:523–531 48 Overvad K, Diamant B, Holm L, Holmer G, Mortensen SA, Stender S (1999) “Q10 in health and disease” Europ J Clin Nutr 53:764–70 49 LLC p 31–43 Zhang Z, Inserra PF, Watson RR (1997), “Antioxidants and AIDS” Antioxidants and disease prevention New York: CRC Press 55 PHỤ LỤC Bảng 2.1 Đồ thị đường chuẩn CoQ10 Hàm 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 lượng CoQ10 (mg/l) 0D620 0,075 0,1715 0,2565 0,363 0,455 0,5455 0,633 0,725 0,8075 0,888 Bảng 2.2 Đồ thị đường chuẩn DPPH Hàm 0,0 0,015625 0,03125 0,0625 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0 lượng DPPH (mM/l) 0D620 0,0485 0,0765 0,1635 0,3095 0,609 1,1475 2,107 3,789 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh tổng hợp CoQ10 Nguồn cacbon sucrose Lactose manose Glucose xylose Galactose Hàm lượng CoQ10 16,0 11,0 14,2 14,6 9,1 15,1 (mg/l) Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến sinh tổng hợp CoQ10 Nồng độ sucrose (%) 0,0 2,5 5,0 7,5 10 Hàm lượng CoQ10 6,2 13,97 18,42 13,33 10,79 (mg/l) 56 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp CoQ10 Nguồn Peptone Trytone Cao malt Cao nấm men CSL (NH4)2SO4 Ure 14,96 18,10 20,09 18,68 26,68 17,95 nitơ Hàm lượng CoQ10 13,55 (mg/l) Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ CSL đến sinh tổng hợp CoQ10 Nồng độ 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 51,84 54,19 39,55 30,27 26,84 22,07 CSL (%) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đầu đến sinh tổng hợp CoQ10 pH 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Hàm lượng CoQ10 34,97 54,27 54,07 66,54 68,82 (mg/l) Bảng 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng giống đến sinh tổng hợp CoQ10 Hàm 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 67,80 90,09 100,30 103,82 108,76 100,66 91,89 58,69 lượng giống OD 600 Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 57 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh tổng hợp CoQ10 Nhiệt độ 20 25 28 30 37 45,82 91,29 125,08 84,64 13,52 (0C) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) Bảng 3.8 Ảnh hƣởng thời gian đến sinh tổng hợp CoQ10 Thời gian 24 48 72 96 120 144 54,41 76,68 112,36 123,93 123,06 128,22 ( giờ) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) Phụ lục : Ma trận thực nghiệm 58 Phụ lục 2: Kết phân tích phương sai mơ hình (ANOVA) Phụ lục 3: Phương trình hồi quy biểu diễn phụ thuộc sinh tổng hợp CoQ10 vào yếu tố môi trường 59 Phụ lục 4: Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp CoQ10 60 ... điều kiện nuôi cấy A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10  Tối ưu hóa điều kiện ni A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10  Tách chiết CoQ10  Khảo sát số đặc tính CoQ10 PHẦN I TỔNG... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LƯU HỒNG SƠN TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH Chun... nấm men có khả sinh tổng hợp CoQ10 Xuất phát từ lý nêu tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Tối ƣu hóa điều kiện ni Agrobacterium tumefaciens sinh tổng hợp coenzyme Q10 xác định số đặc tính? ??’ Trong nghiên