Thiết bị Hãng sản xuất, nƣớc
Nồi khử trùng
Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 Máy Spin Down C1301B-230V Máy đo pH
Máy ổn nhiệt DTU-2C Máy lắc ổn nhiệt eppendorf
Máy li tâm Eppendorf Legend X1R Máy li tâm Facol Sorval Legend X1R Máy cô đặc SPD 1010
Máy siêu âm Tủ lạnh sâu -200C Tủ lạnh Heracus +40C Tủ sấy
Máy đo quang UVIS genequant 1300 Máy đọc vi phiến - Elisa
Hệ thống lên men 2 lít Sắc ký lỏng cao áp Cân kỹ thuật TE 612 Cân kỹ thuật CPA 324S Máy ổn nhiệt DTU-2C
Harayama, Nhật Bản ESCO
Labnet, Đức Mettler Toledo Taitec,Nhật Bản
Torrey pines scientificinc, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Misonix, Mỹ Sanyo, Nhật Bản Thermo Fisher, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Đức BioRad, Mỹ Sartorius – Đức Agilent, Mỹ Satorius, CHLB Đức Satorius, CHLB Đức Taitec, Nhật Bản
23
2.1.4. Các môi trƣờng sử dụng
Bảng 2.2: Các mơi trường sử dụng trong q trình nghiên cứu
Môi trƣờng Thành phần (g/100 ml)
Mơi trường hoạt hóa (MT1) Glucose: 6; pepton: 1,5; cao nấm men:1,5; NaCl: 0,75
Môi trường sinh tổng hợp CoQ10(MT2) Sucrose: 5; pepton: 2; cao nấm men: 2,0; (NH4)2SO4: 1,0; KH2 PO4: 0,05;
K2HPO4: 0,05; CaCO3: 0,2; MgSO4. 7H2O: 0,02
Môi trường sinh tổng hợp CoQ10 (MT3) Sucrose: 5,0; CSL: 1,0; (NH4)2SO4: 2,0; KH2 PO4: 0,05; K2HPO4: 0,05; CaCO3: 0,2; MgSO4. 7H2O: 0,02
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Nuôi A.tumerfaciens tái tổ hợp bằng phƣơng pháp ni cấy chìm
- Hoạt hóa chủng trong mơi trường hoạt hóa, bổ sung kháng sinh Kannamycin nồng độ 50µg/ml. Ni ở 30oC, lắc 130 vịng/phút ni trong 24 giờ.
- Tiến hành lên men trên môi trường tổng hợp CoQ10, bổ sung kháng sinh Kannamycin nồng độ 50µg/ml. Ni ở 30oC, lắc 130 vịng/phút. Ni trong 96 giờ, kết thúc tiến hành thu sinh khối bằng ly tâm, tốc độ 8000 vòng/ phút, thu và rửa sinh khối bằng Tris- HCl pH 7,5.
2.2.1.2.Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 trong
quá trình lên men
A. tumefaciens DPXS12 được ni trong bình tam giác trên môi trường MT2
ở nhiệt độ 300C, tốc độ lắc 130 vịng/phút ở các điều kiện ni khác nhau về nguồn cacbon, nồng độ sucrose từ 0 – 10%; nguồn nitơ khác nhau; nồng độ CSL 0,5 – 5%,
24
pH từ 5 – 8, tỷ lệ cấp giống từ 0,365x108, nhiệt độ từ 20 – 370C, thời gian từ 1 – 5 ngày. Định kỳ lấy mẫu và phân tích sinh khối, pH và hàm lượng Coenzyme Q10.
2.2.2. Phƣơng pháp hóa lý – hóa sinh
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết CoQ10
Trong nghiên cứu này 4 phương pháp phá vỡ tế bào kết hợp với tách chiết CoQ10 khác nhau đã được sử dụng bao gồm phương pháp siêu âm, xử lý bằng axit HCl, xử lý bằng ethanol và xử lý bằng enzyme. Phương pháp siêu âm và xử lý axit được thực hiện dựa theo quy trình được mơ tả bởi Tian và cộng sự [20]. Phương pháp xử lý bằng enzyme được tiến thành theo Zahiri và cộng sự [25].
Phương pháp xử lý bằng enzyme: sinh khối thu được sau lên men bổ sung lysis buffer ủ 37°C trong 30 phút. Ly tâm , bổ sung n-hexane:n-propanol. Lặp lại bước chiết 2 lần. CoQ10 được hòa tan trở lại trong ethanol 100% và bảo quản ở 4oC.
Phương pháp xử lý bằng HCl: sinh khối thu được sau lên men bổ sung HCl tỷ lệ 10,8 ml/ g sinh khối, bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha trên, cơ đặc ở 450C. CoQ10 được hịa tan trở lại trong ethanol 100%.
Phương pháp xử lý bằng siêu âm: sinh khối thu được sau lên men đem siêu âm (10 giây hoạt động, 10 giây nghỉ, 60% năng lượng) , dịch sau siêu âm bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha trên, cô đặc ở 450C. CoQ10 được hòa tan trở lại trong ethanol 100%.
Phương pháp xử lý bằng ethanol được thực hiện như sau: sinh khối thu được sau lên men được trộn đều với ethanol theo các tỷ lệ khác nhau sau đó ủ ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau. Hỗn hợp thu được sẽ được trộn với hexane theo tỷ lệ 1:1 để chiết CoQ10. CoQ10 được thu nhận bằng cách cô chân không đến khi hexane bay hơi hồn tồn. CoQ10 được hịa tan trở lại trong ethanol 100% và bảo quản ở 4oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
25
2.2.2.2 Xác định hàm lƣợng CoQ10 theo phƣơng pháp của caraven (1968)dựa
trên phản ứng tạo màu giữa ethyl cyanoacetate.
Nguyên tắc
Xác định hàm lượng CoQ10 dựa trên phản ứng tạo màu giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10. Những ion từ II đến V được hình thành trong phản ứng tạo màu xanh trong mơi trường kiềm [5].
Hình 2.1. Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10 [5]
Phƣơng pháp tiến hành:
Dựng đồ thị đường chuẩn CoQ10: Chuẩn bị dung dịch CoQ10 tinh khiết nồng độ từ 0,1 – 1 (mg/ ml). Đo độ hấp thụ quang của dung dịch CoQ10 ở bước sóng 620 nm ở các nồng độ khác nhau. Khi thay dung dịch CoQ10 bằng EtOH 100% ta có mẫu đối chứng.
100 l dung dịch CoQ10 tinh khiết bổ sung100 µl ethyl cyanoacetat.Chuẩn bị blank (mẫu đối chứng) bằng cách dùng Ethanol thay cho CoQ10.Trộn đều, ủ ở 6 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó, thêm 20 µl KOH 0,2N tan trong ethanol 100%. Trộn đều, ủ 6 phút ở nhiệt độ phòng. Đo kết quả phản ứng trong thiết bị đo quang, bước sóng 620 nm.Độ hấp thụ quang của dung dịch phản ứng dựa vào đồ thị đường chuẩn CoQ10 tính được nồng độ CoQ10 có trong mẫu.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn CoQ10 :
Y= 0,909x – 0,038 R2= 0,999
26
Phương trình tính tốn hàm lượng được viết như sau: X (mg)= [(Abs + 0,038) : 0,909]*D Trong đó: X : hàm lượng CoQ10 có trong mẫu phản ứng
Abs: giá trị hấp thụ quang phổ của mẫu ở bước sóng 620nm D : là hệ số pha loãng của mẫu
2.2.3.Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng cách loại bỏ gốc tự do DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ.
Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa được minh họa bằng phản ứng sau: N N. NO2 NO2 O2N N NH NO2 NO2 O2N DPPH DPPHH
Hình 2.2. Phương trình phản ứng trung hịa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa
27
Dựng đồ thị đường chuẩn DPPH: Chuẩn bị dung dịch DPPH tinh khiết. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch DPPH ở bước sóng 620 nm ở các nồng độ khác nhau.
Đƣờng chuẩn DPPH
Dựa vào đồ thị đường chuẩn CoQ10 : Y= 2,114x + 0,033
R2= 0,997
2.2.4. Khảo sát đặc tính CoQ10
* Xác định độ bền nhiệt độ
CoQ10 được xác định hàm lượng tại các nhiệt độ trong dải 40C – 600C. Để xác định độ bền nhiệt của CoQ10, CoQ10 được ủ tại các nhiệt độ kiểm tra trong 144 giờ trong EtOH 100%. Cứ sau 24 giờ , xác định hàm lượng CoQ10. Đánh giá độ bền CoQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại so với đối chứng.
* Xác định độ bền pH
Để xác định độ bền pH của CoQ10, CoQ10 được hòa tan trong ethanol 100% được điều chỉnh ở các pH từ 5 - 9. Sau 24 giờ xác định hàm lượng CoQ10còn lại ở điều kiện tiêu chuẩn trong 120 giờ. Đánh giá độ bền CoQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại so với đối chứng.
28
* Xác định độ bền ánh sáng
Để xác định độ bền ánh sáng của CoQ10, dung dịch CoQ10 được giữ ở điều kiện chiếu ánh sáng phịng thí nghiệm liên tục và tối ( bọc giấy bạc) . Sau 24 giờ xác định hàm lượng CoQ10 còn lại ở điều kiện tiêu chuẩn trong 144 giờ. Đánh giá độ bền CoQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại so với đối chứng.
2.2.5. Kiểm tra, định lƣợng bằng HPLC
Phân tích CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC). Dịch chiết CoQ10 được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột C18 (250 mm x 4,6 mm), sử dụng ethanol và methanol là pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là 350C, bước sóng hấp phụ 275 nm. CoQ10 trong mẫu được xác định dựa vào phổ HPLC của CoQ10 chuẩn chạy trong cùng điều kiện.
Hình 2.3: Sơ đồ nguyên lý của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
(1: Bình chứa pha động., 2: Bộ phận khử khí, 3: Bơm cao áp, 4: Bộ phận tiêm mẫu,
5: Cộ sắc ký (pha tĩnh), 6: Đầu dị , 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống, 8: In dữ liệu).
29
2.2.6. Phƣơng pháp toán học
Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng tới điều kiện nuôi cấy chủng Agrobacterium
tumefacienstái tổ hợp bằng quy hoạch bậc 2 Box - Behnken.
Q trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến q trình tổng hợp CoQ10 được tiến hành theo phương pháp bề mặt đáp ứng và quy hoạch Box-Behnken sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ).
Bước 1. Xây dựng mơ hình tốn học dạng y= b0 + b1X1 + b11 X12+ b2 X2 + b22 X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
Trong đó : Y: hàm mục tiêu
Xi : Các biến mã số (chỉ nhận các giá trị -1, 0. +1)
bi : các hệ số diễn tả mức độ ảnh hưởng của các biến Xi đến hàm mục tiêu.
- Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố.
Bảng 2.3: Các biến số và khoảng chạy của chúng
Biếnsố Yếutố Đơnvị Mức -1 Mức +1
X1 Nồng độ sucrose % 2,5 7,5
X2 Nồng độ dịch chiết cao ngô % 0,5 1,5
X3 Nhiệt độ oC 24 32
- Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Behnken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó có 5 thí nghiệm lặp ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 2.4).
30 Bảng 2.4: Ma trận thực nghiệm TN Nồng độ sucrose (X1) (%) Nồng độ dịch chiết cao ngô
(X2) (%) Nhiệt độ (X3) (độ C) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 1 2,5 0,5 28 2 2,5 1,5 28 3 7,5 0,5 28 4 7,5 1,5 24 5 5,0 0,5 24 6 5,0 1,5 24 7 5,0 0,5 32 8 5,0 1,5 32 9 2,5 1,0 24 10 7,5 1,0 24 11 2,5 1,0 32 12 7,5 1,0 32 13 5,0 1,0 32 14 5,0 1,0 28 15 5,0 1,0 28 16 5,0 1,0 28 17 5,0 1,0 28 - Tiến hành thực nghiệm
Nuôi A. tumefacienstái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp ni cấy chìm. Chúng tơi tiến hành ni trên bình tam giác 100ml với thể tích mơi trường ni là 25ml. Môi trường nuôi bao gồm (NH4)2SO4 2%; KH2PO4 0,05%; K2HPO4 0,05%; CaCO3 0,2%; MgSO4.7H2O 0,02%; sucrose thay đổi 2,5; 5,0 và 7,5%, dịch chiết cao ngô thay đổi nồng độ tương ứng: 0,5; 1,0 và 1,5%. Sau đó chuẩn pH về 8,0 cấp giống OD 660nm vào là 0,05. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 24, 28 và320C tương ứng với ma trận thực nghiệm(bảng 2.4). Sau 96 giờ lắc ở 130 vòng/phút, ly tâm thu sinh khối. Tách chiết thu CoQ10 và tiến hành xác định hàm lượng định lượng CoQ10 thu được dựa vào phản ứng của Craven ở bước sóng 620nm. Dựa theo đường chuẩn CoQ10 tính hàm lượng CoQ10
31
- Tính tốn hệ số của hàm hồi quy.
- Kiểm tra độ phù hợp của mơ hình và sự có nghĩa của các hệ số hồi quy. - Đánh giá sự sai lệch giữa mơ hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher.
Bước 2. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kỳ vọng
Tìm cực trị của phương trình hồi quy y= b0 + b1X1 + b11 X12+ b2 X2 + b22 X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert 7.15 cho các kết quả đạt giá trị cực trị tại X1, X2, X3tương ứng với giá trị nồng độ sucrose, nồng độ bột chiết cao ngô và nhiệt độ.
Vậy hiệu suất sinh tổng hợp CoQ10 đạt giá trị lớn nhất tại X1, X2, X3tương ứng với giá trị nồng độ sucrose, nồng độ dịch chiết cao ngô và nhiệt độ thu được.
32
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Khảo sát thành phần môi trƣờng nuôi cấy 3.1.1. Khảo sát nguồn cacbon
Cacbon đóng một vai trị quan trọng không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật do vậy chúng tơi tiến hành thí nghiệm : A. tumerfaciens ni
với 6 nguồn cacbon: sucrose, glucose, lactate, mannose, xylose, galactose với nồng độ 5% (50 g/l)nuôi trong bình tam giác 250 ml ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 vòng/phút, thời gian 96 giờ. Ly tâm, thu sinh khối, xác định hàm lượng CoQ10. Tiến hành tách và định lượng CoQ10. Kết quả biểu diễn ở hình 3.1
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Qua hình 3.1 thấy rằng đường sucrose, manose, glucose và galactose cho hàm lượng CoQ10 cao hơn đáng kể với xylose và lactose sucrose. Trong đó sucrose cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 16 (mg/l), xylose cho hàm lượng CoQ10 thấp nhất 9,1m g/l. Điều này có thể giải thích bởi xylose là loại đường 5 cacbon chính vì vậy chủng A.tumefaciens tái tổ hợp ít sử dụng nguồn cacbon này nên sinh trưởng,
phát triển và sinh tổng hợp CoQ10 chậm nên hàm lượng CoQ10 cho thấp.Mặt khác sucrose được sản xuất ở qui mô công nghiệp với giá thành thấp. Điều này có ý nghĩa lớn cho việc lên men công nghiệp sản xuất CoQ10.
33
Kết quả này cũng trùng hợp với Ha và cs ( 2007) khi nghiên cứu với A.tumerfaciens KCCM 10413, Soo Ryun Cheong và cs ( 2008)
Chính vì vậy, chúng tơi chọn đường sucrose là nguồn carbon sử dụng để lên men sản xuất CoQ10 từ chủng A. tumefacienstái tổ hợpcho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.Khảo sát về nồng độ sucrose
Tiến hành nuôi cấy trên các sucrose nồng độ khác nhau: 0,0; 2,5; 5,0; 7,5 và10%. Sau đó tách chiết CoQ10 bằng ethanol và n-Hexan. Kết quả biểu diễn ở hình 3.2
Hình 3.2 : Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Quá trình sinh tổng hợp CoQ10 cũng chịu tác động bởi tốc độ sinh trưởng của A. tumerfaciens.Kết quả hình 3.2 cho thấy khi tăng nồng độ sucrose từ 0 -5%, thì hàm lượng CoQ10 cũng tăng, tại nồng độ sucrose ở 5,0% ( 50 g/l) cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 15,75 (mg/l). Tiếp tục tăng nồng độ sucrose từ 5% - 10% thì hàm lượng CoQ10 giảm .Ở nồng độ sucrose từ 0 – 5% cho hàm lượng CoQ10 thấp vì sucrose khơng đủ cho vi khuẩn sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10 của vi khuẩn. Với sucrose5 - 10% ở nồng độ này không phù hợp cho vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10. Nồng độ sucrose cao làm tăng độ nhớt trong canh trường dẫn đến làm giảm độ oxy hòa tan, làm hạn chế tổng hợp CoQ10.Kết quả cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đó như Ha và cs (2007), Narendra Kumar và cs (2012), Soon-Ok Kim và cs ( 2009).
34
Như vậy, nồng độ sucrose 5,0% phù hợp và được lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp theo tổng hợp CoQ10 trong canh trường gián đoạn .
3.1.3. Khảo sát về nguồn nitơ
Chúng tơi tiến hành thí nghiệm với 7 nguồn nitơ khác nhau, bao gồm nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ: peptone, tryptone, cao nấm men, dịch chiết malt, cao nấm men, dịch chiết cao ngô, (NH4)2S04,ure với hàm lượng 4% ( 40 g/l), sucrose 5,0% ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 (vòng/phút), thời gian 96 giờ. Ly tâm, thu sinh khối, xác định hàm lượng CoQ10. Kết quả thể hiện trên hình 3.3
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.3 cho thấy nguồn nitơ từ dịch chiết cao ngô, cao nấm men, dịch chiết malt, tryptone, (NH4)2S04cho hàm lượng CoQ10 cao hơn từ nguồn peptone và ure.Trong đó dịch chiết cao ngô cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 26,68 mg/l.Trong thành phần của bột chiết cao ngơ cơng bố có protein: tối thiểu 45%, phosphor: tối thiểu 1%. S02 tối đa 0,1%, pH (nồng độ 1%): 4,0 – 4,5. Cacbon hydrat: tối thiếu 8% và thành phần khác: tối đa 0,5%. CoQ10 là sản phẩm thu thứ cấp và quá trình do nhiều enzyme tham gia. Vì vậy có thể các thành phần trên của bột chiết cao ngô tác động đển các enzyme tham gia chuyển hóa tạo CoQ10.
35
Hơn nữa dịch chiết cao ngơ có giá thành thấp, sản xuất ở qui mô công nghiệp hơn so với một số nguồn nitơ khác như cao nấm men, peptone… Vì vậy chúng tôi chọn dịch chiết cao ngô là nguồn nitơ cho các nghiên cứu tiếp theo.Nghiên cứu của Soon-