3.2 .Khảo sát điều kiện nuôi cấy
3.2.1 .Khảo sát ảnh hưởng pH đầu
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 20, 25, 28, 30 và 370C. pH = 7,0; lắc 130 vòng/phút, thời gian 96 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.7
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ ni cấy đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.7 cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 20 - 280Chàm lượng CoQ10 tăng theo, tại 280C cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 125,08 (mg/l). Tiếp tục tăng nhiệt độ từ 28-370C cho hàm lượng CoQ10 giảm, thấp nhất tại 370C đạt 13,57 (mg/l). Các chủng khác nhau có nhiệt độ tối ưu sinh CoQ10 khác nhau, dao động trong khoảng 28-320C. Kết quả nghiên cứu phù hợp nghiên cứu của Titan và csđối với chủng
A.tumerfaciens 1.2554.
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian
Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy thay đổi theo thời gian. Khi chủngA. tumefaciens tái tổ hợp, nó phát triển trong mơi trường chứa kháng sinh và mật độ tăng theo thời gian. Cùng với sự phát triển theo thời gian thì khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cũng thay thay đổi.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens với qui trình như ở trên . Cứ sau 24 giờ nuôi cấy lấy 25 ml dịch nuôi đem ly tâm, phá tế bào và xác định hàm lượng CoQ10 cho đến 144 giờ
39
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men lên quá thâyrình sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên theo thời gian lên men (hình 3.8). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 theo thời gian, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% (tăng 2,57 mg/l) so với 96 giờ lên men. Kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu của Ha, Cheong và cs.
3.3. Kết quả tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng tới điều kiện nuôi cấy chủng A.
tumefacienstái tổ hợp bằng quy hoạch bậc 2 Box-Behnken.
Để đạt hiệu quả sinh tổng hợp CoQ10 cao. Dựa trên cơ sở đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy chủng A. tumefacienstái tổ hợp đơn yếu tố. Chúng tôi
nhận thấy nồng độ sucrose, nồng độ dịch chiết cao ngô và nhiệt độ nuôi là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình tổng hợp CoQ10.
Chúng tôi sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) để xây dựng quy hoạch bậc 2 Box-Behnken. Ba yếu tố đã được lựa chọn để xác định ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp CoQ10 là: X1- dịch chiết cao ngô, X2-sucrose, X3- nhiệt độ. Hàm mục tiêu Y: Hàm lượng CoQ10 thu được xác định theo OD 620nm. Dựa theo đường chuẩn CoQ10 tính hàm lượng CoQ10. Tiến hành 17 thí nghiệm được thiết kế bởi phần mềm Design-Expert 7.15.
40
Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được
TN Nồng độ Sucrose
(%)
Nồng độ dịch chiết cao ngô
(%) Nhiệt độ (0C) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 1 2,5 0,5 28 115,518 2 2,5 1,5 28 101,791 3 7,5 0,5 28 110,285 4 7,5 1,5 28 105,901 5 5,0 0,5 24 89,872 6 5,0 1,5 24 88,365 7 5,0 0,5 32 93,571 8 5,0 1,5 32 69,048 9 2,5 1,0 24 83,433 10 7,5 1,0 24 90,831 11 2,5 1,0 32 78,912 12 7,5 1,0 32 82,885 13 5,0 1,0 28 126,177 14 5,0 1,0 28 122,478 15 5,0 1,0 28 128,506 16 5.0 1.0 28 126,588 17 5.0 1.0 28 125,355
41
Từ số liệu bảng 3.1 nhận thấy hàm lượng CoQ10 cao nhất ở thí nghiệm 15, hàm lượng CoQ10 đạt 128,506 mg/l. Trong khi đó hàm lượng CoQ10 thấp nhất ở thí nghiệm 8, đạt 69,048 mg/l.
Bảng 3.2 Phân tích phương sai ANOVA của mơ hình
Thơng số SS Df MS Chuẩn F Mức có nghĩa p
Mơ hình 5841,3 9 649,03 95,98 0,0001 Nồng độ sucrose (X1) 25,38 1 25,38 3,75 0,0939 Nồng độ bột chiết cao ngô(X2) 201,41 1 201,41 29,79 0,0009 Nhiệt độ (X3) 98,60 1 98,60 14,58 0,0066 X12 406,27 1 406,27 60,08 0,0001 X22 313,16 1 313,16 46,31 0,0003 X32 4306,90 1 4306,9 636,92 0,0001 X1× X2 7,14 1 7,14 1,06 0,3384 X1× X3 2,93 1 2,93 0,43 0,5312 X2× X3 132,43 1 132,43 0,43 0,031 Residual 47,33 7 6,76 Lack of Fit 28,02 3 9,34 1,93 0,2659
Sai số (pure error) 19,32 4
SS tổng số 5888,63 16
SS: Tổng phương sai; df: bậc tự do; MS: trung bình bình phương sai: Chuẩn F: chuẩn Fisher; Residual: phần dư; “ Lack of Fit”: chuẩn đánh giá độ
42
Kết quả phân tích phương sai của mơ hình tối ưu bằng phần mềm Design-Expert 7.15 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) trình bày trong bảng 3.2 (bảng ANOVA) cũng cho thấy 3 yếu tố đều có ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp CoQ10. Giá trị F của mơ hình là 95, 98 với p=0,0001 ( p< 0,05) cho thấy dạng mô hình đã được lựa chọn đúng. Giá trị p của “Lack of Fit” là 0,2659 ( p >0,05) cho thấy mơ hình này tương hợp với thực nghiệm.
Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết cao ngơ tới q trình sinh tổng hợp CoQ10 mạnh nhất (p <0,05), tiếp theo ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ (p <0,05) và yếu tố ít ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp CoQ10 là nồng độ sucrose. Nhận thấy tương tác giữa nồng độ dịch chiết cao ngô và nhiệt độ (X2×X3) cho ảnh hưởng mạnh tới sinh tổng hợp CoQ10. Tương tác giữa nồng độ sucrose và nhiệt độ (X1×X3) cho ảnh hưởng yếu tới sự tổng hợp CoQ10.
Chúng tôi cũng đưa ra được phương trình biểu hiện hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn: Y= + 125,82 + 1,78.X1 – 5,02.X2 – 3,51.X3 + 1,34.X1X2 - 0,86.X1X3 – 5,75.X2X3 – 9,82.X12 – 0,862.X22 – 31,98.X32
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hàm lượng CoQ10 thu được bằng phần mềm Design-Expert 7.15. Kết quả tìm được 43 phương án thí nghiệm có thể cực đại hàm mục tiêu. Phương án tốt nhất được dự đoán là : nồng độ sucrose 5,18 %, nồng độ dịch chiết cao ngơ 0,86 % và nhiệt độ 27,870C
Hình 3.9. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CoQ10.
(a) Khi nồng độ bột chiết cao ngô và nồng độ sucrose thay đổi, (b) Khi nhiệt độ và nồng độ bột chiết cao ngô thay đổi, (c) khi nhiệt độ và nồng độ sucrose thay
43
Hình 3.10. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh CoQ10
Giá trị đo phản ứng Craven hàm lượng CoQ10 đạt được trong các điều kiện trên theo tính tốn là xấp xỉ 126,63 mg/l. Kết quả này có độ tương thích cao với kết quả kiểm tra lại bằng thực nghiệm(Giá trị đo phản ứng Craven của CoQ10cao nhất đạt 128,506 mg/l).
3.4. Tách chiết CoQ10
3.4.1. Khảo sát phƣơng pháp tách chiết
Coenyzme Q10 (CoQ10) là một hợp chất có độ kỵ nước cao, khơng hịa tan trong nước. Trong tế bào sống, CoQ10 nằm trên màng sinh chất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực [2], do đó khơng thể thu nhận CoQ10 từ dịch lên men. Sau khi lên men sinh khối vi khuẩn sẽ được thu nhận, rửa bỏ các thành phần môi trường và được sử dụng làm nguyên liệu để tách chiết CoQ10. Để tách chiết CoQ10, tế bào cần phải được phá vỡ để giải phóng hợp chất này ra mơi trường. Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10. Trong nghiên cứu này màng tế bào A. tumefaciens được pháp vỡ bằng bốn phương pháp khác nhau bao gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl, xử lý bằng ethanol và xử lý bằng enzyme. Kết quả cho thấy xử lý tế bào ethanol cho hiệu quả thu nhận CoQ10 cao hơn so với các phương pháp khác được sử dụng (hình 1). Tương tự như những vi khuẩn Gram âm khác, A. tumefaciens có chứa một lớp thành trong và màng ngồi
44
mỏng do đó dưới tác động của ethanol sẽ làm các tương tác kỵ nước trên màng sẽ bị làm yếu đi dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nằm trên màng [46]. Tương tự ethanol, axit HCl cũng có vai trị làm giải phóng lipopolysaccharide và các thành phần khác từ màng tế bào từ đó làm cho cấu trúc của màng bị phá vỡ [47]. Tuy nhiên do CoQ10 là một chất kỵ nước nên hiệu quả giải phóng hợp chất này bởi ethanol là cao hơn so với HCl. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nhận được trong nghiên cứu này.
Hình 3.11. Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10.
Ngồi việc sử dụng hóa chất, một số enzyme như protease K, lysozyme cũng được xử dụng để phá vỡ tế bào trong nhiều nghiên cứu ở quy mơ phịng thí nghiệm. Tuy nhiên trong nghiên cứu này việc sử dụng enyzme có hiệu quả thấp hơn so với hai phương pháp xử lý bằng ethanol và HCl. Phương pháp siêu âm cũng là một trong số những phương pháp thường được sử dụng để phá vỡ tế bào vì đây là phương pháp đơn giản, nhanh và ít tốn kém. Tuy nhiên trong quá trình siêu âm thường tạo ra các bọt khí rất nhỏ dẫn đến việc phá vỡ tế bào khơng hồn tồn [47]. So với các phương pháp trên hiệu quả phá vỡ tế bào thu nhận CoQ10 bằng phương pháp siêu âm là thấp nhất. Dựa vào các kết quả nhận được trong nghiên cứu này, phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol đã được lựa chọn.
3.4.2. Kiểm tra tinh sạch CoQ10 sau tách chiết bằng HPLC
Phân tích CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC). Dịch chiết CoQ10 được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột C18 (250
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Siêu âm HCl EtOH Enzyme
O D _ 6 2 0 n m Phương pháp xử lý tế bào
45
mm x 4,6 mm), sử dụng ethanol và methanol là pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là 350C. CoQ10 trong mẫu được xác định dựa vào phổ HPLC của CoQ10 chuẩn chạy trong cùng điều kiện. Kết quả được thể hiện ở hình 3.12
a,
b,
Hình 3.12 Sắc ký đồ dịch chiết CoQ10 chuẩn (a) và dịch chiết CoQ10 sau tinh sạch (b)
Kết quả hình 3.12 cho thấy ở hình (3.12 b) cũng xuất hiện 1 pick tương đồng với CoQ10 (Hình 3.12 a) khá rõ nét. Mặt khác chỉ xuất hiện 2 pick phụ rất nhỏ, thể hiện chế phầm CoQ10 thu được cũng khá tinh sạch.
46
3.5.Khảo sát một số đặc tính của CoQ10
3.5.1.Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới độ bền CoQ10
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền CoQ10. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm như sau:
- Dung dịch CoQ10 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC, 37oC, 60oC) - Tiến hành đo hàm lượng CoQ10 tại các thời điểm 0, 24, 32, 48, 54, 72, 96 và
144 giờ. Kết quả biểu diễn trên hình 3.13
Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền CoQ10
. Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi sau 144 giờ ở tất cả các điều kiện nhiệt độ được khảo sát (hình 3.14). Kết quả này hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trước đây của Fir và cs [26]. Từ kết quả trên có thể thấy CoQ10 có tính bền nhiệt cao, điều này có ý nghĩa trong chế biến, bảo quản cũng như ứng dụng của CoQ10 sau này. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu, bảo quản CoQ10 tiến hành ở nhiệt độ phòng.
3.5.2.Khảo sát ảnh hƣởng của pH tới độ bền của CoQ10
pH là một trong những yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ bền cũng như hoạt tính của các hợp chất sinh học. Việc xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của
0 20 40 60 80 100 120 0h 24h 48h 72h 96h 120h 144h Đ ộ b ề n tươ n g đ ố i (% )
Thời gian (giờ)
47
CoQ10giúp xác định được công thức điều chế cũng như điều kiện bảo quản phù hợp. Trong nghiên cứu này độ bền của CoQ10 được xác định ở các giá trị pH 5-9. Kết quả cho thấy CoQ10 tương đối bền trong dải pH 6-9. Độ bền tương đối đạt khoảng 95% sau 120 giờ (hình 3.14). Tuy nhiên độ bền của CoQ10 giảm đi trong điều kiện axit. Hàm lượng CoQ10 giảm đi khoảng 18% sau 24 giờ và 32% sau 120 giờ.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH tới độ bền CoQ10
3.5.3. Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng tới hoạt tính CoQ10
Để khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng tới hàm lượng CoQ10. CoQ10 được giữ ở hai điều kiện khác nhau là giữ tối và chiếu sáng liên tục. Hàm lượng CoQ10 thay đổi được xác định sau mỗi 24 giờ trong 144 giờ.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của ánh sáng tới hoạt tính CoQ10
0 20 40 60 80 100 120 0h 24h 48h 72h 96h 120h Đ ộ b ề n tươ n g đ ố i (% )
Thời gian (giờ)
48
Khi để CoQ10 tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng trong phịng thí nghiệm liên tục thì sau 24 giờ hàm lượng CoQ10 bị tổn thất là 32%. Thời gian tiếp xúc ánh sáng càng nhiều thì hàm lượng CoQ10 càng giảm. Sau 144 giờ bị tổn thất là 72%. Trong khi đó, mẫu được bọc giấy bạc sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 hầu như giảm không đáng kể. Ánh sáng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính CoQ10. Điều này rất quan trọng, khi bảo quản CoQ10 cần tránh ánh sáng.
3.5.4. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của CoQ10 bằng DPPH
Ngồi vai trị quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, CoQ10còn là một trong các chất chống oxy hóa tự nhiên rất tốt. Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 có thể được xác định thơng qua làm giảm màu của thuốc thử DPPH, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ. Kết quả cho thấy CoQ10 tại nồng độ 0,18 mM có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH.
49
50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau q trình tiến hành thí nghiệm, chúng tơi thu được các kết quả sau:
1. Bước đầu khảo sát của một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp CoQ10. Dựa vào kết quả khảo sát này để lựa chọn khoảng các giá trị thích hợp của các biến trong thí nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp CoQ10.
- Nguồn C: Sucrose 5% - Nguồn Nitơ: CSL 1% - Nhiệt độ 280C
- pH 7
- Tỷ lệ giống ban đầu (OD = 0,8)
2. Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box-Behnken đã tìm được các điều kiện tối ưu nuôi chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợplà sucrose 5,17%, nồng độ dịch chiết cao ngô 0,86%, nhiệt độ 27,87 oC, pH 7, thời gian nuôi 96 giờ.
3. Đã xác định một số đặc tính cơ bản của CoQ10: CoQ10 khá bền với nhiệt độ từ 4 – 600C, pH 6 – 9, khơng bền khi có ánh sáng. Có hoạt tính chống oxy hóa EC50 = 0,18 mM.
KIẾN NGHỊ
- Tiến hành lên men ở qui mô pilot
- Xác định tiếp một số hoạt tính sinh học của CoQ10 như khả năng chống ung thư, HIV,…
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009), “Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập ở Việt Nam”,
Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học, số 5,
trang 8-14.
2. Ngô Thị Xuyên, Lê Lương Tề, (2006), “Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciensvà bệnh u sùi rễ hoa hồng tại một số tình miền
Bắc Việt Nam”. Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội. Tiếng Anh
3. Arroyo, A.; Navarro, F.; Navas, P.; Villalba, J. M. (1998). "Ubiquinol regeneration by plasma membrane ubiquinone reductase". Protoplasma 205:
107-13
4. Battino, Maurizio; Ferri, Elida; Gorini, Antonella; Villa, Roberto Federico; Huertas, Jesus Francisco Rodriguez; Fiorella, Pierluigi; Genova, Maria Luisa; Lenaz, Giorgio; Marchetti, Mario (1990). "Natural Distribution and Occurrence of Coenzyme Q Homologues". Molecular Membrane Biology9
(3): 179–90.
5. Elliot Redalieu, Inger M. Nilsson, Thomas M. Farley and Karl Folkers, 1968. Determination and Levels of Coenzyme Q10 in Human Blood.
Analytical Biochemistry23, 132-140.
6. Frederick L. Crane, PhD (2001) “Biochemical Functions of Coenzyme Q10”
Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana.
7. Ha S.J., Kim S.Y., Seo J.H., Oh D.K., Lee J.K. (2007), “Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens”, Appl Microbiol Biotechnol 74: pp. 974-980.
8. Hectors MPC, van Tits LJH, de Rijke YB, Demacker PNM (2003). “Stability