3.1 .Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy
3.1.2 .Khảo sát về nồng độ sucrose
Tiến hành nuôi cấy trên các sucrose nồng độ khác nhau: 0,0; 2,5; 5,0; 7,5 và10%. Sau đó tách chiết CoQ10 bằng ethanol và n-Hexan. Kết quả biểu diễn ở hình 3.2
Hình 3.2 : Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Quá trình sinh tổng hợp CoQ10 cũng chịu tác động bởi tốc độ sinh trưởng của A. tumerfaciens.Kết quả hình 3.2 cho thấy khi tăng nồng độ sucrose từ 0 -5%, thì hàm lượng CoQ10 cũng tăng, tại nồng độ sucrose ở 5,0% ( 50 g/l) cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 15,75 (mg/l). Tiếp tục tăng nồng độ sucrose từ 5% - 10% thì hàm lượng CoQ10 giảm .Ở nồng độ sucrose từ 0 – 5% cho hàm lượng CoQ10 thấp vì sucrose khơng đủ cho vi khuẩn sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10 của vi khuẩn. Với sucrose5 - 10% ở nồng độ này không phù hợp cho vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10. Nồng độ sucrose cao làm tăng độ nhớt trong canh trường dẫn đến làm giảm độ oxy hòa tan, làm hạn chế tổng hợp CoQ10.Kết quả cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đó như Ha và cs (2007), Narendra Kumar và cs (2012), Soon-Ok Kim và cs ( 2009).
34
Như vậy, nồng độ sucrose 5,0% phù hợp và được lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp theo tổng hợp CoQ10 trong canh trường gián đoạn .
3.1.3. Khảo sát về nguồn nitơ
Chúng tơi tiến hành thí nghiệm với 7 nguồn nitơ khác nhau, bao gồm nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ: peptone, tryptone, cao nấm men, dịch chiết malt, cao nấm men, dịch chiết cao ngô, (NH4)2S04,ure với hàm lượng 4% ( 40 g/l), sucrose 5,0% ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 (vòng/phút), thời gian 96 giờ. Ly tâm, thu sinh khối, xác định hàm lượng CoQ10. Kết quả thể hiện trên hình 3.3
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.3 cho thấy nguồn nitơ từ dịch chiết cao ngô, cao nấm men, dịch chiết malt, tryptone, (NH4)2S04cho hàm lượng CoQ10 cao hơn từ nguồn peptone và ure.Trong đó dịch chiết cao ngô cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 26,68 mg/l.Trong thành phần của bột chiết cao ngơ cơng bố có protein: tối thiểu 45%, phosphor: tối thiểu 1%. S02 tối đa 0,1%, pH (nồng độ 1%): 4,0 – 4,5. Cacbon hydrat: tối thiếu 8% và thành phần khác: tối đa 0,5%. CoQ10 là sản phẩm thu thứ cấp và quá trình do nhiều enzyme tham gia. Vì vậy có thể các thành phần trên của bột chiết cao ngô tác động đển các enzyme tham gia chuyển hóa tạo CoQ10.
35
Hơn nữa dịch chiết cao ngơ có giá thành thấp, sản xuất ở qui mô công nghiệp hơn so với một số nguồn nitơ khác như cao nấm men, peptone… Vì vậy chúng tôi chọn dịch chiết cao ngô là nguồn nitơ cho các nghiên cứu tiếp theo.Nghiên cứu của Soon- Ok Kim và cs ( 2010), Hajime Yoshida và cs (1998) cũng cho kết quả tương tự. Vì vậy chúng tơi chọn nguồn nitơ là dịch chiết cao ngô cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Khảo sát nồng độ dịch chiết cao ngô (CSL)
Để khảo sát nồng độ CSL thích hợp. Chúng tơi niA. tumefaciens tái tổ hợp vớicác dải nồng độ bột chiết cao ngô 0,0;0,5;1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0% với sucrose 5,0% ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 (vòng/phút), thời gian 96 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.4
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ bột chiết cao ngô đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.4 cho thấykhi tăng nồng độ dịch chiết cao ngô từ 0,5 – 1% hàm lượng CoQ10 cũng tăng. Đạt cao nhất ở nồng độ1,0% cho hàm lượng CoQ10 54,19 (mg/l).Tiếp tục tăng nồng độ dịch chiết cao ngô từ 1 – 5% hàm lượng CoQ10 giảm xuống.Thấp nhất tại 5% đạt 22,07 (mg/l). Theo Ha và cs(2007) nghiên cứu A. tumefaciens KCCM 10413 cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 45,8 mg/l với dịch chiết cao ngơ 4,0%. Điều này có thể được giải thích ở nồng độ bột chiết cao ngô thấp 0,5% chưa cung cấp đủ nguồn nitơ,… để A.tumerfaciens sinh trưởng, phát triển
36
và sinh tổng hợp CoQ10. Ngược lại ở nồng độ dịch chiết cao ngô từ 2 – 5%, A.
tumerfaciens sinh trưởng phát triển nhanh chóng dẫn đến giảm hàm lượng oxy hòa
tan, cũng như cạn kiệt nhanh chóng các nguồn dinh dưỡng khác. Do vậy ảnh hưởng xấu đển sinh tổng hợp CoQ10.