Biếnsố Yếutố Đơnvị Mức -1 Mức +1
X1 Nồng độ sucrose % 2,5 7,5
X2 Nồng độ dịch chiết cao ngô % 0,5 1,5
X3 Nhiệt độ oC 24 32
- Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Behnken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó có 5 thí nghiệm lặp ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 2.4).
30 Bảng 2.4: Ma trận thực nghiệm TN Nồng độ sucrose (X1) (%) Nồng độ dịch chiết cao ngô
(X2) (%) Nhiệt độ (X3) (độ C) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 1 2,5 0,5 28 2 2,5 1,5 28 3 7,5 0,5 28 4 7,5 1,5 24 5 5,0 0,5 24 6 5,0 1,5 24 7 5,0 0,5 32 8 5,0 1,5 32 9 2,5 1,0 24 10 7,5 1,0 24 11 2,5 1,0 32 12 7,5 1,0 32 13 5,0 1,0 32 14 5,0 1,0 28 15 5,0 1,0 28 16 5,0 1,0 28 17 5,0 1,0 28 - Tiến hành thực nghiệm
Nuôi A. tumefacienstái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp ni cấy chìm. Chúng tơi tiến hành ni trên bình tam giác 100ml với thể tích mơi trường ni là 25ml. Môi trường nuôi bao gồm (NH4)2SO4 2%; KH2PO4 0,05%; K2HPO4 0,05%; CaCO3 0,2%; MgSO4.7H2O 0,02%; sucrose thay đổi 2,5; 5,0 và 7,5%, dịch chiết cao ngô thay đổi nồng độ tương ứng: 0,5; 1,0 và 1,5%. Sau đó chuẩn pH về 8,0 cấp giống OD 660nm vào là 0,05. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 24, 28 và320C tương ứng với ma trận thực nghiệm(bảng 2.4). Sau 96 giờ lắc ở 130 vòng/phút, ly tâm thu sinh khối. Tách chiết thu CoQ10 và tiến hành xác định hàm lượng định lượng CoQ10 thu được dựa vào phản ứng của Craven ở bước sóng 620nm. Dựa theo đường chuẩn CoQ10 tính hàm lượng CoQ10
31
- Tính tốn hệ số của hàm hồi quy.
- Kiểm tra độ phù hợp của mơ hình và sự có nghĩa của các hệ số hồi quy. - Đánh giá sự sai lệch giữa mơ hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher.
Bước 2. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kỳ vọng
Tìm cực trị của phương trình hồi quy y= b0 + b1X1 + b11 X12+ b2 X2 + b22 X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert 7.15 cho các kết quả đạt giá trị cực trị tại X1, X2, X3tương ứng với giá trị nồng độ sucrose, nồng độ bột chiết cao ngô và nhiệt độ.
Vậy hiệu suất sinh tổng hợp CoQ10 đạt giá trị lớn nhất tại X1, X2, X3tương ứng với giá trị nồng độ sucrose, nồng độ dịch chiết cao ngô và nhiệt độ thu được.
32
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Khảo sát thành phần môi trƣờng ni cấy 3.1.1. Khảo sát nguồn cacbon
Cacbon đóng một vai trị quan trọng không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật do vậy chúng tơi tiến hành thí nghiệm : A. tumerfaciens ni
với 6 nguồn cacbon: sucrose, glucose, lactate, mannose, xylose, galactose với nồng độ 5% (50 g/l)nuôi trong bình tam giác 250 ml ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 vòng/phút, thời gian 96 giờ. Ly tâm, thu sinh khối, xác định hàm lượng CoQ10. Tiến hành tách và định lượng CoQ10. Kết quả biểu diễn ở hình 3.1
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Qua hình 3.1 thấy rằng đường sucrose, manose, glucose và galactose cho hàm lượng CoQ10 cao hơn đáng kể với xylose và lactose sucrose. Trong đó sucrose cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 16 (mg/l), xylose cho hàm lượng CoQ10 thấp nhất 9,1m g/l. Điều này có thể giải thích bởi xylose là loại đường 5 cacbon chính vì vậy chủng A.tumefaciens tái tổ hợp ít sử dụng nguồn cacbon này nên sinh trưởng,
phát triển và sinh tổng hợp CoQ10 chậm nên hàm lượng CoQ10 cho thấp.Mặt khác sucrose được sản xuất ở qui mô công nghiệp với giá thành thấp. Điều này có ý nghĩa lớn cho việc lên men công nghiệp sản xuất CoQ10.
33
Kết quả này cũng trùng hợp với Ha và cs ( 2007) khi nghiên cứu với A.tumerfaciens KCCM 10413, Soo Ryun Cheong và cs ( 2008)
Chính vì vậy, chúng tơi chọn đường sucrose là nguồn carbon sử dụng để lên men sản xuất CoQ10 từ chủng A. tumefacienstái tổ hợpcho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.Khảo sát về nồng độ sucrose
Tiến hành nuôi cấy trên các sucrose nồng độ khác nhau: 0,0; 2,5; 5,0; 7,5 và10%. Sau đó tách chiết CoQ10 bằng ethanol và n-Hexan. Kết quả biểu diễn ở hình 3.2
Hình 3.2 : Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Quá trình sinh tổng hợp CoQ10 cũng chịu tác động bởi tốc độ sinh trưởng của A. tumerfaciens.Kết quả hình 3.2 cho thấy khi tăng nồng độ sucrose từ 0 -5%, thì hàm lượng CoQ10 cũng tăng, tại nồng độ sucrose ở 5,0% ( 50 g/l) cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 15,75 (mg/l). Tiếp tục tăng nồng độ sucrose từ 5% - 10% thì hàm lượng CoQ10 giảm .Ở nồng độ sucrose từ 0 – 5% cho hàm lượng CoQ10 thấp vì sucrose khơng đủ cho vi khuẩn sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10 của vi khuẩn. Với sucrose5 - 10% ở nồng độ này không phù hợp cho vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10. Nồng độ sucrose cao làm tăng độ nhớt trong canh trường dẫn đến làm giảm độ oxy hòa tan, làm hạn chế tổng hợp CoQ10.Kết quả cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đó như Ha và cs (2007), Narendra Kumar và cs (2012), Soon-Ok Kim và cs ( 2009).
34
Như vậy, nồng độ sucrose 5,0% phù hợp và được lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp theo tổng hợp CoQ10 trong canh trường gián đoạn .
3.1.3. Khảo sát về nguồn nitơ
Chúng tơi tiến hành thí nghiệm với 7 nguồn nitơ khác nhau, bao gồm nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ: peptone, tryptone, cao nấm men, dịch chiết malt, cao nấm men, dịch chiết cao ngô, (NH4)2S04,ure với hàm lượng 4% ( 40 g/l), sucrose 5,0% ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 (vòng/phút), thời gian 96 giờ. Ly tâm, thu sinh khối, xác định hàm lượng CoQ10. Kết quả thể hiện trên hình 3.3
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.3 cho thấy nguồn nitơ từ dịch chiết cao ngô, cao nấm men, dịch chiết malt, tryptone, (NH4)2S04cho hàm lượng CoQ10 cao hơn từ nguồn peptone và ure.Trong đó dịch chiết cao ngô cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 26,68 mg/l.Trong thành phần của bột chiết cao ngơ cơng bố có protein: tối thiểu 45%, phosphor: tối thiểu 1%. S02 tối đa 0,1%, pH (nồng độ 1%): 4,0 – 4,5. Cacbon hydrat: tối thiếu 8% và thành phần khác: tối đa 0,5%. CoQ10 là sản phẩm thu thứ cấp và quá trình do nhiều enzyme tham gia. Vì vậy có thể các thành phần trên của bột chiết cao ngô tác động đển các enzyme tham gia chuyển hóa tạo CoQ10.
35
Hơn nữa dịch chiết cao ngơ có giá thành thấp, sản xuất ở qui mô công nghiệp hơn so với một số nguồn nitơ khác như cao nấm men, peptone… Vì vậy chúng tôi chọn dịch chiết cao ngô là nguồn nitơ cho các nghiên cứu tiếp theo.Nghiên cứu của Soon- Ok Kim và cs ( 2010), Hajime Yoshida và cs (1998) cũng cho kết quả tương tự. Vì vậy chúng tơi chọn nguồn nitơ là dịch chiết cao ngô cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Khảo sát nồng độ dịch chiết cao ngơ (CSL)
Để khảo sát nồng độ CSL thích hợp. Chúng tơi niA. tumefaciens tái tổ hợp vớicác dải nồng độ bột chiết cao ngô 0,0;0,5;1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0% với sucrose 5,0% ở nhiệt độ 30oC, pH=7,lắc 130 (vòng/phút), thời gian 96 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.4
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ bột chiết cao ngô đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.4 cho thấykhi tăng nồng độ dịch chiết cao ngô từ 0,5 – 1% hàm lượng CoQ10 cũng tăng. Đạt cao nhất ở nồng độ1,0% cho hàm lượng CoQ10 54,19 (mg/l).Tiếp tục tăng nồng độ dịch chiết cao ngô từ 1 – 5% hàm lượng CoQ10 giảm xuống.Thấp nhất tại 5% đạt 22,07 (mg/l). Theo Ha và cs(2007) nghiên cứu A. tumefaciens KCCM 10413 cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 45,8 mg/l với dịch chiết cao ngơ 4,0%. Điều này có thể được giải thích ở nồng độ bột chiết cao ngô thấp 0,5% chưa cung cấp đủ nguồn nitơ,… để A.tumerfaciens sinh trưởng, phát triển
36
và sinh tổng hợp CoQ10. Ngược lại ở nồng độ dịch chiết cao ngô từ 2 – 5%, A.
tumerfaciens sinh trưởng phát triển nhanh chóng dẫn đến giảm hàm lượng oxy hịa
tan, cũng như cạn kiệt nhanh chóng các nguồn dinh dưỡng khác. Do vậy ảnh hưởng xấu đển sinh tổng hợp CoQ10.
3.2.Khảo sát điều kiện nuôi cấy 3.2.1.Khảo sát ảnhhƣởng pH đầu 3.2.1.Khảo sát ảnhhƣởng pH đầu
Để khảo sát pH môi trường thích hợp, tơi tiến hành lên men A. tumefaciens
với thành phần môi trường như đã khảo sát bên trên, cụ thể nguồn cacbon là sucrose 5,0%, nguồn nitơ là CSL 1,0% và các thành phần thiết yếu khác tôi đã tiến hành chuẩn bị mơi trường ni cấy trong 5 bình tam giác 250 ml khác nhau, điều chỉnh pH về tại các giá trị lần lượt là: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0 nuôi ở nhiệt độ 37oC lắc 130 vịng/phút ni trong vịng 96 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.5
Hình 3.5.Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả cho thấy với pH đầu = 8,0 A. tumefacienscho khả năng sinh tổng hợp tốt nhất đạt 68,8 mg/L sau 96 giờ (hình 3.5). Mặc dù pH đầu = 8, nhưng trong qúa trình lên men pH giảm dần và hàm lượng CoQ10 đạt cao tại pH = 6, 95. Điều này cũng phù hợp với một số tài liệu của Ha và cs ( 2007), soon – Ok Kim và cs (2010) công bố.
37
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống
Để khảo sát hàm lượng giống thích hợp, tơi tiến hành lên men A. tumefaciens với thành phần môi trường như đã khảo sát bên trên, cụ thể nguồn cacbon là sucrose 5,0%, nguồn nitơ là CSL 1,0% , pH = 8, các thành phần thiết yếu khác tôi đã tiến hành chuẩn bị mơi trường ni cấy trong 8 bình tam giác 250 ml khác nhau, điều chỉnh hàm lượng giống được đo ở OD 660 nm các giá trị lần lượt là: 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6 và 2,0 nuôi ở nhiệt độ 37oC lắc 130 vịng/phút ni trong vịng 96 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.6
Hình 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Qua hình 3.6 cho thấy hàm lượng giống có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp CoQ10. Khi tăng hàm lượng giống OD660 từ 0,05 – 0,8 thì hàm lượng CoQ10 tăng. Đạt cao nhất hàm lượng giống OD660 = 0,8 là 108,76 (mg/l) hàm lượng giống ít kéo dài thời gian sinh trưởng của A.tumefaciens nênsinh tổng hợp CoQ10 thấp. Tiếptăng hàm lượng giống từ 0,8 – 2hàm lượng CoQ10 giảm. Điều này có thể giải thích hàm lượng giống cao sinh trưởng tốt, thu được sinh khối nhiều, song nhanh chuyển sang giai đoạn suy vong do vậy sẽ giảm hàm lượng CoQ10. Nồng độ giống thích hợp để sinh hổng hợp CoQ10 là OD660 = 0,8, CoQ10 đạt 108,76 (mg/l). Tương đương 5,84.108 (cfu/ml). 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 Co Q10 (m g/ l)
38
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 20, 25, 28, 30 và 370C. pH = 7,0; lắc 130 vòng/phút, thời gian 96 giờ. Kết quả thể hiện trên hình 3.7
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả hình 3.7 cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 20 - 280Chàm lượng CoQ10 tăng theo, tại 280C cho hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 125,08 (mg/l). Tiếp tục tăng nhiệt độ từ 28-370C cho hàm lượng CoQ10 giảm, thấp nhất tại 370C đạt 13,57 (mg/l). Các chủng khác nhau có nhiệt độ tối ưu sinh CoQ10 khác nhau, dao động trong khoảng 28-320C. Kết quả nghiên cứu phù hợp nghiên cứu của Titan và csđối với chủng
A.tumerfaciens 1.2554.
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian
Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy thay đổi theo thời gian. Khi chủngA. tumefaciens tái tổ hợp, nó phát triển trong môi trường chứa kháng sinh và mật độ tăng theo thời gian. Cùng với sự phát triển theo thời gian thì khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cũng thay thay đổi.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens với qui trình như ở trên . Cứ sau 24 giờ nuôi cấy lấy 25 ml dịch nuôi đem ly tâm, phá tế bào và xác định hàm lượng CoQ10 cho đến 144 giờ
39
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men lên quá thâyrình sinh tổng hợp CoQ10
Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên theo thời gian lên men (hình 3.8). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 theo thời gian, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% (tăng 2,57 mg/l) so với 96 giờ lên men. Kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu của Ha, Cheong và cs.
3.3. Kết quả tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng tới điều kiện nuôi cấy chủng A.
tumefacienstái tổ hợp bằng quy hoạch bậc 2 Box-Behnken.
Để đạt hiệu quả sinh tổng hợp CoQ10 cao. Dựa trên cơ sở đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy chủng A. tumefacienstái tổ hợp đơn yếu tố. Chúng tôi
nhận thấy nồng độ sucrose, nồng độ dịch chiết cao ngô và nhiệt độ nuôi là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình tổng hợp CoQ10.
Chúng tôi sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) để xây dựng quy hoạch bậc 2 Box-Behnken. Ba yếu tố đã được lựa chọn để xác định ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp CoQ10 là: X1- dịch chiết cao ngô, X2-sucrose, X3- nhiệt độ. Hàm mục tiêu Y: Hàm lượng CoQ10 thu được xác định theo OD 620nm. Dựa theo đường chuẩn CoQ10 tính hàm lượng CoQ10. Tiến hành 17 thí nghiệm được thiết kế bởi phần mềm Design-Expert 7.15.
40
Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được
TN Nồng độ Sucrose
(%)
Nồng độ dịch chiết cao ngô
(%) Nhiệt độ (0C) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 1 2,5 0,5 28 115,518 2 2,5 1,5 28 101,791 3 7,5 0,5 28 110,285 4 7,5 1,5 28 105,901 5 5,0 0,5 24 89,872 6 5,0 1,5 24 88,365 7 5,0 0,5 32 93,571 8 5,0 1,5 32 69,048 9 2,5 1,0 24 83,433 10 7,5 1,0 24 90,831 11 2,5 1,0 32 78,912 12 7,5 1,0 32 82,885 13 5,0 1,0 28 126,177 14 5,0 1,0 28 122,478 15 5,0 1,0 28 128,506 16 5.0 1.0 28 126,588 17 5.0 1.0 28 125,355
41
Từ số liệu bảng 3.1 nhận thấy hàm lượng CoQ10 cao nhất ở thí nghiệm 15, hàm lượng CoQ10 đạt 128,506 mg/l. Trong khi đó hàm lượng CoQ10 thấp nhất ở thí nghiệm 8, đạt 69,048 mg/l.
Bảng 3.2 Phân tích phương sai ANOVA của mơ hình
Thông số SS Df MS Chuẩn F Mức có nghĩa p
Mơ hình 5841,3 9 649,03 95,98 0,0001 Nồng độ sucrose (X1) 25,38 1 25,38 3,75 0,0939 Nồng độ bột chiết cao ngô(X2) 201,41 1 201,41 29,79 0,0009 Nhiệt độ (X3) 98,60 1 98,60 14,58 0,0066 X12 406,27 1 406,27 60,08 0,0001 X22 313,16 1 313,16 46,31 0,0003 X32 4306,90 1 4306,9 636,92 0,0001 X1× X2 7,14 1 7,14 1,06 0,3384 X1× X3 2,93 1 2,93 0,43 0,5312 X2× X3 132,43 1 132,43 0,43 0,031 Residual 47,33 7 6,76 Lack of Fit 28,02 3 9,34 1,93 0,2659
Sai số (pure error) 19,32 4
SS tổng số 5888,63 16
SS: Tổng phương sai; df: bậc tự do; MS: trung bình bình phương sai: Chuẩn F: chuẩn Fisher; Residual: phần dư; “ Lack of Fit”: chuẩn đánh giá độ
42
Kết quả phân tích phương sai của mơ hình tối ưu bằng phần mềm Design-Expert 7.15 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) trình bày trong bảng 3.2 (bảng ANOVA) cũng cho thấy 3 yếu tố đều có ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp CoQ10. Giá trị F của mơ hình là 95, 98 với p=0,0001 ( p< 0,05) cho thấy dạng mơ hình đã được lựa chọn đúng. Giá trị p của “Lack of Fit” là 0,2659 ( p >0,05) cho thấy mơ hình này tương hợp với thực nghiệm.
Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết cao ngơ tới q trình sinh tổng hợp CoQ10 mạnh nhất (p <0,05), tiếp theo ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ (p <0,05) và yếu tố ít ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp CoQ10 là nồng độ sucrose. Nhận thấy tương tác giữa nồng độ dịch chiết cao ngơ và nhiệt độ (X2×X3) cho ảnh hưởng mạnh tới sinh tổng hợp CoQ10. Tương tác giữa nồng độ sucrose và nhiệt độ (X1×X3) cho ảnh hưởng yếu tới sự tổng hợp CoQ10.
Chúng tôi cũng đưa ra được phương trình biểu hiện hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn: