3.2 .Khảo sát điều kiện nuôi cấy
3.2.1 .Khảo sát ảnh hưởng pH đầu
3.4. Tách chiết CoQ10
3.4.1. Khảo sát phƣơng pháp tách chiết
Coenyzme Q10 (CoQ10) là một hợp chất có độ kỵ nước cao, khơng hịa tan trong nước. Trong tế bào sống, CoQ10 nằm trên màng sinh chất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực [2], do đó khơng thể thu nhận CoQ10 từ dịch lên men. Sau khi lên men sinh khối vi khuẩn sẽ được thu nhận, rửa bỏ các thành phần môi trường và được sử dụng làm nguyên liệu để tách chiết CoQ10. Để tách chiết CoQ10, tế bào cần phải được phá vỡ để giải phóng hợp chất này ra mơi trường. Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10. Trong nghiên cứu này màng tế bào A. tumefaciens được pháp vỡ bằng bốn phương pháp khác nhau bao gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl, xử lý bằng ethanol và xử lý bằng enzyme. Kết quả cho thấy xử lý tế bào ethanol cho hiệu quả thu nhận CoQ10 cao hơn so với các phương pháp khác được sử dụng (hình 1). Tương tự như những vi khuẩn Gram âm khác, A. tumefaciens có chứa một lớp thành trong và màng ngồi
44
mỏng do đó dưới tác động của ethanol sẽ làm các tương tác kỵ nước trên màng sẽ bị làm yếu đi dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nằm trên màng [46]. Tương tự ethanol, axit HCl cũng có vai trị làm giải phóng lipopolysaccharide và các thành phần khác từ màng tế bào từ đó làm cho cấu trúc của màng bị phá vỡ [47]. Tuy nhiên do CoQ10 là một chất kỵ nước nên hiệu quả giải phóng hợp chất này bởi ethanol là cao hơn so với HCl. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nhận được trong nghiên cứu này.
Hình 3.11. Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10.
Ngồi việc sử dụng hóa chất, một số enzyme như protease K, lysozyme cũng được xử dụng để phá vỡ tế bào trong nhiều nghiên cứu ở quy mơ phịng thí nghiệm. Tuy nhiên trong nghiên cứu này việc sử dụng enyzme có hiệu quả thấp hơn so với hai phương pháp xử lý bằng ethanol và HCl. Phương pháp siêu âm cũng là một trong số những phương pháp thường được sử dụng để phá vỡ tế bào vì đây là phương pháp đơn giản, nhanh và ít tốn kém. Tuy nhiên trong quá trình siêu âm thường tạo ra các bọt khí rất nhỏ dẫn đến việc phá vỡ tế bào khơng hồn tồn [47]. So với các phương pháp trên hiệu quả phá vỡ tế bào thu nhận CoQ10 bằng phương pháp siêu âm là thấp nhất. Dựa vào các kết quả nhận được trong nghiên cứu này, phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol đã được lựa chọn.
3.4.2. Kiểm tra tinh sạch CoQ10 sau tách chiết bằng HPLC
Phân tích CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC). Dịch chiết CoQ10 được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột C18 (250
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Siêu âm HCl EtOH Enzyme
O D _ 6 2 0 n m Phương pháp xử lý tế bào
45
mm x 4,6 mm), sử dụng ethanol và methanol là pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là 350C. CoQ10 trong mẫu được xác định dựa vào phổ HPLC của CoQ10 chuẩn chạy trong cùng điều kiện. Kết quả được thể hiện ở hình 3.12
a,
b,
Hình 3.12 Sắc ký đồ dịch chiết CoQ10 chuẩn (a) và dịch chiết CoQ10 sau tinh sạch (b)
Kết quả hình 3.12 cho thấy ở hình (3.12 b) cũng xuất hiện 1 pick tương đồng với CoQ10 (Hình 3.12 a) khá rõ nét. Mặt khác chỉ xuất hiện 2 pick phụ rất nhỏ, thể hiện chế phầm CoQ10 thu được cũng khá tinh sạch.
46