2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Chủng vi sinh vật 2.1.1. Chủng vi sinh vật
Chủng dùng trong thí nghiệm là chủngAgrobacterium tumefaciensDPXS12tái tổ hợp do Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
- Các hóa chất dùng trong ni cấy chủng tái tổ hợp: glucose; sucrose; peptone; cao nấm men; NaCl; MgSO4.7H2O; KH2PO4; K2HPO4; CaCO3; (NH4)2SO4.... của Trung Quốc.- Hóa chất dùng để phá vỡ tế bào ethanol 100%; acid HCl (3 mol/L) của Trung Quốc ; Lysozyme; Lysis Buffer gồm sucrose 8%; Triton X100 5%; Tris HCl,pH=8,0 (50mM); EDTA,pH = 8,0 (50mM).
- Hóa chất để tách chiết Coenzyme Q10 gồm: Tris HCl 7,5 (2mM); n-hexane: n- propanol (5:3); ethanol100 % (Merck); petroleum ether của Trung Quốc.
- Hóa chất dùng để xác định CoQ10 gồm: ethanol100 %; ethylcyanoacetate; KOH 0,2N được pha trong ethanol100 % của Merck.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng thuộc Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, bao gồm:
22
Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng
Thiết bị Hãng sản xuất, nƣớc
Nồi khử trùng
Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 Máy Spin Down C1301B-230V Máy đo pH
Máy ổn nhiệt DTU-2C Máy lắc ổn nhiệt eppendorf
Máy li tâm Eppendorf Legend X1R Máy li tâm Facol Sorval Legend X1R Máy cô đặc SPD 1010
Máy siêu âm Tủ lạnh sâu -200C Tủ lạnh Heracus +40C Tủ sấy
Máy đo quang UVIS genequant 1300 Máy đọc vi phiến - Elisa
Hệ thống lên men 2 lít Sắc ký lỏng cao áp Cân kỹ thuật TE 612 Cân kỹ thuật CPA 324S Máy ổn nhiệt DTU-2C
Harayama, Nhật Bản ESCO
Labnet, Đức Mettler Toledo Taitec,Nhật Bản
Torrey pines scientificinc, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Misonix, Mỹ Sanyo, Nhật Bản Thermo Fisher, Mỹ Thermo Fisher, Mỹ Đức BioRad, Mỹ Sartorius – Đức Agilent, Mỹ Satorius, CHLB Đức Satorius, CHLB Đức Taitec, Nhật Bản
23
2.1.4. Các môi trƣờng sử dụng
Bảng 2.2: Các mơi trường sử dụng trong q trình nghiên cứu
Môi trƣờng Thành phần (g/100 ml)
Mơi trường hoạt hóa (MT1) Glucose: 6; pepton: 1,5; cao nấm men:1,5; NaCl: 0,75
Môi trường sinh tổng hợp CoQ10(MT2) Sucrose: 5; pepton: 2; cao nấm men: 2,0; (NH4)2SO4: 1,0; KH2 PO4: 0,05;
K2HPO4: 0,05; CaCO3: 0,2; MgSO4. 7H2O: 0,02
Môi trường sinh tổng hợp CoQ10 (MT3) Sucrose: 5,0; CSL: 1,0; (NH4)2SO4: 2,0; KH2 PO4: 0,05; K2HPO4: 0,05; CaCO3: 0,2; MgSO4. 7H2O: 0,02
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Nuôi A.tumerfaciens tái tổ hợp bằng phƣơng pháp ni cấy chìm
- Hoạt hóa chủng trong mơi trường hoạt hóa, bổ sung kháng sinh Kannamycin nồng độ 50µg/ml. Ni ở 30oC, lắc 130 vịng/phút ni trong 24 giờ.
- Tiến hành lên men trên môi trường tổng hợp CoQ10, bổ sung kháng sinh Kannamycin nồng độ 50µg/ml. Ni ở 30oC, lắc 130 vịng/phút. Ni trong 96 giờ, kết thúc tiến hành thu sinh khối bằng ly tâm, tốc độ 8000 vòng/ phút, thu và rửa sinh khối bằng Tris- HCl pH 7,5.
2.2.1.2.Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 trong
quá trình lên men
A. tumefaciens DPXS12 được ni trong bình tam giác trên môi trường MT2
ở nhiệt độ 300C, tốc độ lắc 130 vịng/phút ở các điều kiện ni khác nhau về nguồn cacbon, nồng độ sucrose từ 0 – 10%; nguồn nitơ khác nhau; nồng độ CSL 0,5 – 5%,
24
pH từ 5 – 8, tỷ lệ cấp giống từ 0,365x108, nhiệt độ từ 20 – 370C, thời gian từ 1 – 5 ngày. Định kỳ lấy mẫu và phân tích sinh khối, pH và hàm lượng Coenzyme Q10.
2.2.2. Phƣơng pháp hóa lý – hóa sinh
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết CoQ10
Trong nghiên cứu này 4 phương pháp phá vỡ tế bào kết hợp với tách chiết CoQ10 khác nhau đã được sử dụng bao gồm phương pháp siêu âm, xử lý bằng axit HCl, xử lý bằng ethanol và xử lý bằng enzyme. Phương pháp siêu âm và xử lý axit được thực hiện dựa theo quy trình được mơ tả bởi Tian và cộng sự [20]. Phương pháp xử lý bằng enzyme được tiến thành theo Zahiri và cộng sự [25].
Phương pháp xử lý bằng enzyme: sinh khối thu được sau lên men bổ sung lysis buffer ủ 37°C trong 30 phút. Ly tâm , bổ sung n-hexane:n-propanol. Lặp lại bước chiết 2 lần. CoQ10 được hòa tan trở lại trong ethanol 100% và bảo quản ở 4oC.
Phương pháp xử lý bằng HCl: sinh khối thu được sau lên men bổ sung HCl tỷ lệ 10,8 ml/ g sinh khối, bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha trên, cơ đặc ở 450C. CoQ10 được hịa tan trở lại trong ethanol 100%.
Phương pháp xử lý bằng siêu âm: sinh khối thu được sau lên men đem siêu âm (10 giây hoạt động, 10 giây nghỉ, 60% năng lượng) , dịch sau siêu âm bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha trên, cô đặc ở 450C. CoQ10 được hòa tan trở lại trong ethanol 100%.
Phương pháp xử lý bằng ethanol được thực hiện như sau: sinh khối thu được sau lên men được trộn đều với ethanol theo các tỷ lệ khác nhau sau đó ủ ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau. Hỗn hợp thu được sẽ được trộn với hexane theo tỷ lệ 1:1 để chiết CoQ10. CoQ10 được thu nhận bằng cách cô chân không đến khi hexane bay hơi hồn tồn. CoQ10 được hịa tan trở lại trong ethanol 100% và bảo quản ở 4oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
25
2.2.2.2 Xác định hàm lƣợng CoQ10 theo phƣơng pháp của caraven (1968)dựa
trên phản ứng tạo màu giữa ethyl cyanoacetate.
Nguyên tắc
Xác định hàm lượng CoQ10 dựa trên phản ứng tạo màu giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10. Những ion từ II đến V được hình thành trong phản ứng tạo màu xanh trong mơi trường kiềm [5].
Hình 2.1. Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10 [5]
Phƣơng pháp tiến hành:
Dựng đồ thị đường chuẩn CoQ10: Chuẩn bị dung dịch CoQ10 tinh khiết nồng độ từ 0,1 – 1 (mg/ ml). Đo độ hấp thụ quang của dung dịch CoQ10 ở bước sóng 620 nm ở các nồng độ khác nhau. Khi thay dung dịch CoQ10 bằng EtOH 100% ta có mẫu đối chứng.
100 l dung dịch CoQ10 tinh khiết bổ sung100 µl ethyl cyanoacetat.Chuẩn bị blank (mẫu đối chứng) bằng cách dùng Ethanol thay cho CoQ10.Trộn đều, ủ ở 6 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó, thêm 20 µl KOH 0,2N tan trong ethanol 100%. Trộn đều, ủ 6 phút ở nhiệt độ phòng. Đo kết quả phản ứng trong thiết bị đo quang, bước sóng 620 nm.Độ hấp thụ quang của dung dịch phản ứng dựa vào đồ thị đường chuẩn CoQ10 tính được nồng độ CoQ10 có trong mẫu.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn CoQ10 :
Y= 0,909x – 0,038 R2= 0,999
26
Phương trình tính tốn hàm lượng được viết như sau: X (mg)= [(Abs + 0,038) : 0,909]*D Trong đó: X : hàm lượng CoQ10 có trong mẫu phản ứng
Abs: giá trị hấp thụ quang phổ của mẫu ở bước sóng 620nm D : là hệ số pha loãng của mẫu