Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng pedv (porcine epidemic diarrhea virus) ở lợn nuôi tại thái nguyên và hưng yên

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ NHÀN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG PEDV (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) Ở LỢN NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN VÀ HƯNG YÊN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ thực luận án cảm ơn thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phan tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng biểu vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract .x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung virus gây dịch tiêu chảy cấp lợn (PEDV) 2.1.1 Hình thái cấu trúc gen virus 2.1.2 Các loại protein cấu trúc PEDV 2.1.3 Đặc tính ni cấy virus PED tế bào 2.1.4 Tính khơng đồng 2.2 Tình hình nghiên cứu nước nước ngồi 2.2.1 Nghiên cứu nước 2.2.2 Nghiên cứu nước 10 2.3 Tình hình sử dụng vắc-xin phịng PED giới việt nam 15 2.3.1 Trên giới 15 2.3.2 Tại Việt Nam 16 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 18 3.1 Địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Thời gian nghiên cứu .18 3.3 Đối tượng -Vật liệu nghiên cứu 18 3.3.1 Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu 18 iii 3.3.2 Mơi trường, hóa chất 18 3.3.3 Thiết bị, dụng cụ dùng phịng thí nghiệm 18 3.4 Nội dung nghiên cứu 19 3.5 Phương pháp nghiên cứu .19 3.5.1 Phương pháp thu thập xử lí mẫu 19 3.5.2 Phương pháp phân lập virus PED tế bào Vero 20 3.5.3 Phương pháp kiểm tra vô trùng khiết .20 3.5.4 Phương pháp RT – PCR .21 3.5.5 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml) .24 3.5.6 Phương pháp kiểm tra tính độc 25 3.5.7 Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV PED-Ag test kit 26 3.5.8 Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng virus .27 3.5.9 Phương pháp giải trình tự gen 28 3.5.10 Phương pháp xây dựng sinh học phân tử 29 Phần Kết thảo luận 30 4.1 Kết thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV lợn 30 4.2 Kết phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm tế bào vero .31 4.2.1 Kết phân lập PEDV 31 4.2.2 Kết kiểm tra vô trùng khiết hai chủng virus phân lập 34 4.3 Kết xác định số đặc tính sinh học chủng PEDV phân lập 36 4.3.1 Khả thích nghi gây bệnh tích tế bào chủng PEDV phân lập 36 4.3.2 Hiệu giá chủng virus PED phân lập 38 4.3.3 Đường cong sinh trưởng chủng virus PED 40 4.3.4 Kết xác định độc lực chủng PEDV 42 4.3.5 Kết phân tích giải trình tự gen S chủng PEDV 45 4.3.6 Kết so sánh tương đồng nucleotide axit amin 47 Phần Kết luận kiến nghị 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị .51 Tài liệu tham khảo .53 Phụ lục 61 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DEPC Diethyl pyrocarbonate DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium DTT Dithiothreitol ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HY Hưng Yên MTV Một thành viên MOI Multiplicity of infection ORF Open reading frame PBS Phosphate buffered saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic acid RT - PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TCID50 Tissue culture infective dose 50 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TGEV Transmissible gastroenteritis virus TN Thái Nguyên TNHH Trách nhiệm hữu hạn TSB Trypto-casein soy broth v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Chức loại protein cấu tạo PEDV .5 Bảng 2.2 Danh mục loại vắc - xin phòng bệnh PED lưu hành Việt Nam 17 Bảng 3.1 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 22 Bảng 3.2 Trình tự mồi dùng nghiên cứu .22 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR .23 Bảng 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn độ hiệu giá virus PED 24 Bảng Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính độc chủng PEDV phân lập 25 Bảng 3.6 Trình tự mồi sử dụng giải trình tự gen S 28 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng RT - PCR nhân gen S 29 Bảng 4.1 Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV thuộc hai tỉnh Hưng Yên Thái Nguyên 30 Bảng 4.2 Kết phân lập PEDV tế bào Vero 32 Bảng 4.3 Kết kiểm tra tạp khuẩn tạp nấm chủng PEDV 34 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tạp nhiễm virus ngoại lai 35 Bảng 4.5 Khả gây bệnh tích tế bào chủng PEDV phân lập .36 Bảng 4.6 Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn sau uống PEDV với liều khác .42 Bảng 4.7 Mức độ tương đồng (dưới) số nucleotide khác chủng phân lập chủng tham chiếu .47 Bảng 4.8 Mức độ tương đồng (dưới) số amino acid khác chủng phân lập chủng tham chiếu .48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ tổ chức cấu trúc hệ gen virus PED Hình 3.1 Kỹ thuật kiểm tra PEDV kít test nhanh 27 Hình 4.1 Kết chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR 31 Hình 4.2 Biểu bệnh tích tế bào chủng PEDV phân lập kết giám định kỹ thuật RT –PCR 33 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra tạp nhiễm chủng PEDV phân lập với số loại virus gây tiêu chảy lợn khác 35 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào PEDV qua đời cấy truyền 24 sau gây nhiễm 37 Hình 4.5 Biểu đồ biểu thị hiệu giá chủng PEDV phân lập qua đời cấy truyền 39 Hình 4.6 Đường biểu diễn tốc độ sinh trưởng hai chủng virus PED phân lập theo thời gian 40 Hình 4.7 Bệnh tích tế bào theo thời gian 41 Hình 4.8 Một số dấu hiệu lâm sàng ghi nhận lợn thí nghiệm 44 Hình 4.9 Hình ảnh mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm sau gây nhiễm PEDV 45 Hình 4.10 Mối quan hệ di truyền chủng PEDV/TN8/2016 chủng PEDV/HY3/2015 với chủng ham chiếu khác 46 Hình 4.11 Kết trình tự vùng COE 49 Hình 4.12 Kết trình tự vùng định kháng nguyên 49 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Nhàn Tên luận văn: Phân lập xác định số đặc tính sinh học chủng PEDV lợn (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) Thái Nguyên Hưng Yên Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam (VNUA) Mục đích nghiên cứu - Phân lập virus PED để khẳng định chắn lưu hành loại virus Thái Nguyên Hưng Yên - Xác định số đặc tính sinh học chủng virus PED phân lập Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu thập xử lí mẫu Các mẫu bệnh phẩm thu thập theo phương pháp hồi cứu Tức sử dụng mẫu chẩn đốn dương tính với PEDV hai tỉnh Hưng Yên Thái Nguyên từ năm 2015 -2017 kỹ thuật RT – PCR cịn lưu trữ Phịng thí nghiệm Công ty TNHHMTV Avac Việt Nam Mẫu chọn, trước sử dụng cho phân lập virus kiểm tra lại tình trạng mẫu kỹ thuật RT –PCR để giám định lại có mặt PEDV mẫu bệnh phẩm Sau mẫu nghiền đồng thành huyễn dịch 10%, ly tâm lọc qua màng lọc 0,45µm sử dụng cho phân lập PEDV - Phương pháp phân lập PEDV tế bào Vero - Phương pháp kiểm tra vô trùng khiết + Phuơng pháp kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011 + Phương pháp kiểm tra khiết sử dụng kỹ thuật RT – PCR - Phương pháp chuẩn độ virus (TCID50/ml) - Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng virus - Phương pháp xác định tính độc virus - Phương pháp giải trình tự gene - Phương pháp dựng sinh phát sinh chủng loại Kết kết luận - Sau đời cấy truyền mù môi trường tế bào vero, phân lập thành công chủng virus PED (PEDV/TN8/2016 PEDV/HY3/2015) tổng số 22 mẫu bệnh viii phẩm thực địa Hiệu giá virus thu dao động từ 106 - 106,5 TCID50/ml Cả chủng virus đạt tiêu chuẩn vô trùng khiết không tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai - Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng hai chủng PEDV phân lập môi trường tế bào cho thấy, với liều gây nhiễm MOI = 0,01, hiệu giá virus thu đạt cao sau 36 – 48 gây nhiễm - Kết nghiên cứu độc lực virus động vật thí nghiệm cho thấy chủng PEDV phân lập có khả gây bệnh cho lợn thí nghiệm với triệu chứng lâm sàng bệnh tích đặc trưng PED - Kết phân tích phả hệ (phylogenetic tree) cho thấy hai chủng PEDV phân lập nằm nhóm G2b, có mối quan hệ gần gũi với chủng PEDV tham chiếu khác công bố Việt Nam năm gần Hai chủng PEDV phân lập nghiên cứu có mức độ tương đồng trình tự nucleotide (nt) axit amin (aa) cao so sánh với chủng PEDV HUA/PED114 HUA/PED118 tham chiếu khác Việt Nam công bố trước đây, tỷ lệ tương đồng nt aa tương ứng 99% 98% Tuy nhiên, phân tích so sánh với số chủng PEDV tham chiếu khác giời cho thấy mức độ tương đồng nt (92,6 – 93,2%) aa (91,2 – 92,9%) thấp Như vậy, nghiên cứu phân lập thành công chủng PEDV từ thực địa hai chủng virus nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử Hai chủng virus phân lập từ thực địa nguồn nguyên vật liệu vô quan trọng phục vụ cho cơng trình nghiên cứu sản xuất vắc - xin phòng bệnh tiêu chảy cấp lợn (PED) tương lai gần ix - Tiếp tục nghiên cứu bổ sung thêm đặc tính sinh học thiểu chủng PEDV phân lập như: tính ổn định hai chủng virus tế bào, tính sinh miễn dịch lợn - Tối ưu điều kiện nuôi cấy để nâng cao hiệu giá hai chủng virus lên đạt 107TCID50/ml Như tiến hành nghiên cứu tạo vắc xin phịng bệnh tiêu chảy cấp đàn lợn có hiệu - Tiếp tục thu thập phân lập thêm chủng PEDV từ thực địa nhằm làm đa dạng nguồn liệu chủng giống - Nghiên cứu, chế tạo vắc - xin vơ hoạt phịng bệnh tiêu chảy cấp lợn (PED) quy mơ phịng thí nghiệm từ hai chủng PEDV phân lập Đánh giá đáp ứng miễn dịch lợn chủng virus 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Lê Văn Phan, Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Bá Hiên (2015) Một số đặc điểm sinh học phân tử virus gây dịch tiêu chảy cấp lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) Quảng Trị, Thái Nguyên Thái Bình từ năm 2013 - 2014 Tạp chí Khoa học Phát triển 2015 .13 (7) tr 1089 - 1100 Nguyễn Văn Điệp, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hòa Yamaguchi (2014) Một số đặc điểm dịch tễ bệnh lý bệnh tiêu chảy thành dịch lợn số tỉnh phía Bắc Việt Nam Tạp chí KHKT thú y 21 (2) tr 43-55 Nguyễn Tất Tồn, Ngơ Đình Quyết Đỗ Tiến Duy (2013) Một số yếu tố liên quan đặc điểm bệnh học dịch tiêu chảy cấp heo theo mẹ số tỉnh phía Nam Tạp chí KHKT thú y 20 (2) Tr 43-55 Nguyễn Tất Tồn, Ngơ Đình Quyết., Trịnh Thị Thanh, Huyền, Đỗ Tiến Duy , Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Phước Ninh (2012) Phát virus gây tiêu chảy cấp (PEDV) heo tỉnh miền Đơng Nam Bộ Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú y 19 (5) tr 23-28 Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang Lâm, Trịnh Đình Thâu Nguyễn Thị Hạnh (2018) Nghiên cứu phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus PED (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018 16 (3) tr 257-267 II Tài liệu tiếng Anh: Baudoux P., C Carrat, L Besnardeau, B Charley, and H Laude (1998) Coronavirus pseudoparticles formed with recombinant M and E proteins induce alpha interferon synthesis by leukocytes J Virol 72 pp 8636–8643 Bernasconi C., F Guscetti, A Utiger, K Van Reeth, M Ackermann, and A Pospischil (1995) Experimental infections of gnotobiotic piglets with a cell culture adapted porcine epidemic diarrhoea virus : clinical, histopathological and immunohistochemical findings In Immunobiology of Viral Infections pp 542-546 Callebaut P and P Debouck (1981) Some characteristics of a new porcine coronavirus and detection of antigen and antibody by ELISA Int Congr Virol., Strasbourg, France August to pp 420 53 Carvajal A., I Lanza, R Diego, P Rubio, and P Carmenes (1995) Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies J Vet Diagn Invest pp 60-64 10 Chang H., J L Bae, T J Kang, J Kim, G H Chung, W Lim, and Y S Jang (2002) Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus Molecules and cells 14 (2) pp 295-299 11 Chang C.Y., J.Y Peng, C.F Kao, Y.C Chang, C.S Hsueh, C.R Jeng, I.C Cheng, V.F Pang, P.S Tsai, and H.W Chang (2018) Different intestinal tropism of the G2b Taiwan porcine epidemic diarrhea virus-Pintung 52 strain in conventional 7day-old piglets The Veterinary Journal 237 pp 69-75 12 Chasey D.C (1978) Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhoea Res Vet Sci 25 (2) pp 255-256 13 Chen J.F., D B Sun, C.B.Wang, H.Y Shi, X.C Cui, and S.W Liu 2008) Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China Virus Genes 36 pp 355-364 14 Chen Q., G Li, J Stasko, J T Thomas, W R Stensland, A E Pillatzki, P C Gauger, K J Schwartz, D Madson, and K J Yoon (2014) Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States Journal of clinical microbiology 52 pp 234-243 15 Cruz D J M., C J Kim, and H J Shin (2008) The GPRLQPY motif located at the carboxy-terminal of the spike protein induces antibodies that neutralize Porcine epidemic diarrhea virus Virus research 132 (1-2) pp 192-196 16 De Arriba M L., A, Carvajal, J Pozo, and Rubio P (2002) Mucosal and systemic isotype-specific antibody responses and protection in conventional pigs exposed to virulent or attenuated porcine epidemic diarrhoea virus Vet Immunol Immunopathol 85 (1-2) pp 85-97 17 Duarte M., K Tobler, A Bridgen, D Rasschaert, M Ackermann, and H Laude (1994) Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF Virology 198 pp 466-476 54 18 Diep N V., M Sueyoshi, U Izzati, N Fuke, A P P.Teh, N T Lan and R Yamaguchi (2018) App earance of US-like porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) strains before US outbreaks and genetic heterogeneity of PEDV s collected in Northern Vietnam during 2012–2015 Transboundary and emerging diseases 65 (1) pp e83-e93 19 Duarte M., K Tobler, A Bridgen, D Rasschaert, M Ackermann, and H Laude (1994) Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF Virology 198 pp 466-476 20 Ducatelle R., W Coussement, M Pensaert, P Debouck, and Hoorens (1982) Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis in piglets II Electron microscopic study Vet Patho 19 pp 55-66 21 Ge J W and Y.J Li (2012) Construction of recombinant lactobacilli expressing the core neutralizing epitope (COE) of porcine epidemic diarrhea virus and a fusion protein consisting of COE and Escherichia coli heat-labile enterotoxin B, and comparison of the immune responses by orogastric immunization Can J Microbiol 58 (11) pp 1258–1267 22 Gerber P F., Q Gong, Y W Huang, C Wang, and D Holtkamp (2014) Detection of antibodies against porcine epidemic diarrhea virus in serum and colostrum by indirect ELISA Vet J 202 pp 32-36 23 Goede D., R Robbins, L Dufresne, M A Engle, and R B Morrison (2013) Detection of porcine epidemic diarrhea virus in air samples at varying distances to epidemic farms in Oklahoma In: Allen D Leman Swine Conference 40 pp 212 24 Grasland B., L Bigault, C Bernard, H Quenault, O Toulouse, and C Fablet (2015) Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea S gene indel strain isolated in France in December 2014 Genome Announc, pp 535 25 Hanke D., M Jenckel, A Petrov, M Ritzmann, J Stadler, and V Akimkin (2015) Comparison of porcine epidemic diarrhea viruses from Germany and the United States, 2014 Emerg Infect Dis 21 pp 493-496 26 Hao J., C Xue, L He, Y Wang, and Y Cao (2014) Bioinformatics insight into the spike glycoprotein gene of field porcine epidemic diarrhea strains during 2011-2013 in Guangdong, China Virus Genes 49 pp 58-67 55 27 Hofmann M and R Wyler (1988) Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture Journal of clinical microbiology 26 pp 2235–2239 28 Huang Y.W., A.W Dickerman, P Pineyro, L Fang, and R Kiehne (2013) Origin, eution, and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States MBio Journal pp 737 29 Jackwood M W., D.A Hilt, S.A Callison, C W Lee, H Plaza, and E Wade (2001) Spike glycoprotein cleavage recognition site analysis of infectious bronchitis virus Avian Dis 45 pp 366-372 30 Jung K., Wang Q., K A Scheuer, Z Lu, Y S Zhang, and L J Saif (2014) Pathology of US porcine epidemic diarrhea virus strain PC21A in gnotobiotic pigs Emerg Infect Dis 20 pp 662-665 31 Kadoi K., H Sugioka, T Satoh, and B K Kadoi (2002) The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines Microbiologica, 25, 285-290 32 Kim S H., J.M Lee, J Jung, I J Kim, B.H Hyun, and H.I Kim (2015) Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Korea from 1998 to 2013 Arch Virol 60 pp 1055–1064 33 Kim S Y., D S Song, and B K Park (2001) Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR J Vet Diagnos Invest 13 (6) pp 516 - 520 34 Kim Y and C Lee (2013) Ribavirin efficiently supp resses porcine nidovirus replication Virus Res 171 pp 44-53 35 Kocherhans R., A Bridgen, M Ackermann, and K Tobler (2001) Completion of theporcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence Virus Genes 23 pp 137-144 36 Kumar S., G Stecher, and K Tamura (2016) Molecular Eutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Mol Biol E 33 pp 1870–1874 37 Kusanagi K.I., H Kuwahara, T Katoh, T Nunoya, Y Ishikawa, T Samejima and M Tajima (1992) Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate J Vet Med Sci 54 (2) pp 313-318 38 Kweon C H., B J Kwon, J G Lee, and G O Kwon (1999) Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) as vaccine candidate Vaccine 17 (20) pp 2546-2553 56 39 Lai M.C., S Perlman, and L J Anderson (2007) Coronaviridae Fields Virology, pp 1306-1336 40 Lawrence P K., E Bumgardner, R F Bey, D Stine, and R.E Bumgarner (2014) Genome sequences of porcine epidemic diarrhea virus: in vivo and in vitro phenotypes Genome Announc (3) pp 03-14 41 Lee C (2015) Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging epizootic swine virus Virology Journal 12 pp 193 42 Lee D K., C.K Park, S H Kim, and C Lee ( 2010) Heterogeneity in spike protein genesof porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea Virus Virus Res 149 pp 175-182 43 Lee S., G S Park, J H Shin and C Lee (2014) Full-genome sequence analysis of a variantstrain of porcine epidemic diarrhea virus in South Korea Genome Announc pp e01116 44 Lee S and C Lee (2014) Outbreak-Related Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strains Similar to US Strains, South Korea, 2013 Emerging Infectious Diseases, 20 (7) pp 1223–1226 45 Li W., H Li, Y Liu, Y Pan, F Deng, and Y Song (2011) New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China Emerg Infect Dis, 46 Martelli P., A Lavazza, A.D Nigrelli, G Merialdi, L G Alborali, and M B Pensaert (2008) Epidemic of diarrhoea caused by porcine epidemic diarrhoea virus in Italy Veterinary Record 162 pp 307-310 47 María Elena Trujillo-Ortega1, Rolando Beltrán-Figueroa1, Montserrat Elemi García-Hernández2, Mireya Juárez-Ramírez3, Alicia Sotomayor-González1, Erika N Hernández-Villegas2 and Sarmiento-Silva2 (2016) Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea virus associated with the 2014 disease outbreak in Mexico: case report BMC Veterinary Research 12 pp 132 48 Mcbride R., M Van Zyl, and B C Fielding (2014) The coronavirus nucleocapsid is a multifunctional protein Viruses pp 2991–3018 49 Nagy B., M Meder, and E Mocsari (1996) Enterotoxigenic Escherichia coli, rotavirus, porcine epidemic diarrhoea virus, adenovirus and calici-like virus in porcine postweaning diarrhoea in Hungary Acta Vet Hung 44 (1) pp.9–19 50 Nam E and C Lee (2010) Contribution of the porcine aminopeptidase N (CD13) receptor density to porcine epidemic diarrhea virus infection Vet Microbiol pp 144 57 51 Oh J., K W Lee and H W Choi (2014) Immunogenicity and protective efficacy ofrecombinant S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein Arch Virol 159 pp 2977-2987 52 Oka T., D Marthaler, and L.J Saif ( 2014) Cell culture isolation and sequence analysis of genetically diverse US porcine epidemic diarrhea virus strains including a novel strain with a large deletion in the spike gene Vet Microbiol, 173 (3-4) pp 258–269 53 Pensaert M B., P Debouck, and D.J Reynolds (1981) A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine Arch Virol 58 (3) pp 243-247 54 Penseart M and S Yeo (2006) Porcine epidemic diarrhea In: Straw BE, Zimmerman JJ, D’Allaire S, Taylor JD, editors Diseases of swine Ames (IA): Iowa State University Press pp 367-372 55 Pijpers A., A P van Nieuwstadt, C Terpstra , and J H Verheijden (1993) Porcine epidemic diarrhoea virus as a cause of persistent diarrhoea in a herd of breeding and finishing pigs Vet Rec 132 (6) pp 129–131 56 Puranaveja S., P Poolperm, P Lertwatcharasarakul, A Boonsoongnern,, K Urairong, P Kitikoon, P Choojai, R Kedkovid, K Teankum, and R Thanawongnuwech (2009) Chinese like strain of porcine epidemic diarrhea virus Thailand Emerg Infect dis 15 (7) pp 1112 - 1115 57 Saif L J., M B Pensaert, K Sestack, S G Yeo, and K Jung (2012) Coronaviruses Diseases of Swine Ames: Wiley-Blackwell pp 501-524 58 Shibata I., T Tsuda, M Mori, M Ono, M Sueyoshi, and K Uruno (2000) Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell culture and experimental infection of pigs of different ages Veterinary Microbiology pp 72 59 Stevenson G.W., H Hoang, K J Schwartz, E R Burrough, D Sun, and D Madson (2013) Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 25 pp 649-654 60 Sun D., L Feng, H Shi, J Chen, X Cui, H Chen, and G Tong (2008) Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein Veterinary microbiology 131 (1-2) pp 73-81 58 61 Sun D B., L Feng, H Y Shi, J F Chen, S W Liu, H Y Chen, and Y.F Wang (2007) Spike protein region (aa 636789) of porcine epidemic diarrhea virus is essential for induction of neutralizing antibodies Acta virologica 51 (3), pp.149-156 62 Sun R Q., R J Cai, Y Q Chen, P.S Liang, D K Chen, and C X Song (2012) Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China Emerg Infect Dis 18 (1) pp 161-163 63 Takahashi K., K Okada, and K Ohshima (1983) An outbreak of swine diarrhea of a new-type associated with coronavirus-like particles in Japan Nihon Juigaku Zasshi 45 (6) pp 829–832 64 Usami Y., O Yamaguchi, K Kumanomido and Y, M (1998) Antibody response of pregnant sows to porcine epidemic diarrhea virus live vaccine and maternallyDerived Antibodies Of The Piglets J Jpn Vet Med Assoc 51 pp 652-655 65 Vlasova A N., D Marthaler, Q Wang, M R Culhane., K D Rossow, A Rovira, and L J Saif (2014) Distinct Characteristics and Complex Eution of PEDV Strains, North America, May 2013–February (2014) Emerging Infectious Diseases 20 (10) pp 1620–1628 66 Vui D T., N.V.Tung, K Inui, S Slater, and D Nilubol (2014) Complete Genome Sequence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Vietnam Genome Announcements (4) pp 753 67 Wang L and Byrum B (2014) New variant of porcine epidemic diarrhea virus, United States, 2014 Emerg Infect Dis 20 pp 917-920 68 Wang Y, G X.and Yao Y (2015b) The dynamics of Chinese variant porcine epidemic diarrhea virus production in Vero cells and intestines of 2-day old piglets Virus Res 208 pp 82–88 69 Wicht O., Li Wentao, W Lione , J M Tom , W W Richard , Frank J M van Kuppeveld, Peter J M Rottier, and Berend Jan Bosch (2014) Proteolytic activation of the porcine epidemic diarrhea coronavirus spike fusion protein by trypsin in cell culture J Virol 88 (14) pp 7952–7961 70 Wood E N (1977) An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea Vet Rec 100 (12) pp 243–244 59 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN LẬP 22 MẪU BỆNH PHẨM TRÊN TẾ BÀO VERO Kết thep dõi bệnh tích (CPE) Stt Tên mẫu tế bào Vero Loại mẫu P1 P2 P3 P4 P5 PEDV/HY1/2015 Phân - - - - - PEDV/HY2/2015 Phân - - - - - PEDV/HY3/2015 Phân - - + + + PEDV/HY4/2015 Ruột - - - - - PEDV/HY5/2015 Ruột - - - - - PEDV/HY6/2015 Phân - - - - - PEDV/TN1/2015 Ruột - - - - - PEDV/TN2/2015 Phân - - - - - PEDV/TN3/2015 Phân - - - - - 10 PEDV/TN4/2015 Ruột - - - - - 11 PEDV/TN5/2016 Phân - - - - - 12 PEDV/TN6/2016 Phân - - - - - 13 PEDV/TN7/2016 Phân - - - - - 14 PEDV/TN8/2016 Ruột - + + + + 15 PEDV/HY7/2016 Phân - - - - - 16 PEDV/HY8/2016 Phân - - - - - 17 PEDV/HY9/2016 Phân - - - - - 18 PEDV/HY10/2017 Phân - - - - - 19 PEDV/HY11/2017 Phân - - - - - 20 PED/HY12/2017 Phân - - - - - 21 PEDV/TN9/2017 Ruột - - - - - 22 PEDV/TN10/2017 Phân - - - - - 60 PHỤ LỤC TCVN 8684:2011 VẮC - XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y – PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT Veterinary vắc - xins and biological products – Purity test Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp thử độ khiết vắc - xin chế phẩm sinh học dùng thú y Thuốc thử môi trường nuôi cấy 2.1 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 2.1.1 Metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua 2.1.2 Dung dịch sắt (II) clorua axit sulfamic 2.1.3 Formaldehyt chuẩn 2.2 Môi trường nuôi cấy Sử dụng môi trường nuôi cấy pha chế sẵn chuẩn bị môi trường nuôi cấy trước sử dụng 2.2.1 Môi trường thioglycollat 2.2.2 Môi trường trypticaza đậu tương 2.2.3 Thạch máu 2.2.4 Canh thang thịt 2.2.5 Thạch Sabouraud 2.2.6 Sản phẩm thủy phân casein đậu tương 2.2.7 Canh thang PP LO, có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men 2.2.8 Thạch PP LO (tên đầy đủ pleuropneumonia-like organism agar, có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men 2.2.9 Dung dịch DPN-cystein, có bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua huyết ngựa 2.2.10 Canh thang tim, có bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men 2.2.11 Thạch MacConkey 2.2.12 Thạch Salmonella-Shigella 61 2.2.13 Thạch brilliant green 2.2.14 Thạch desoxycholat xitrat 2.2.15 Thạch xyloza lysin deoxycholat (thạch XLD) 2.2.16 Canh thang selenit 2.2.17 Canh thang tetrathionat Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm sinh học thông thường cụ thể sau: 3.1.Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 0C 3.2.Tủ ấm CO2 3.3.Tủ sấy 3.5.Máy lắc 3.7.Máy đo quang phổ, sử dụng cuvet cm, đo bước sóng 628 nm Cách tiến hành 4.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn 4.1.1 Tiến hành 4.1.1.1 Cấy vắc - xin ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat (2.2.1), môi trường trypticaza đậu tương (2.2.2), đĩa môi trường thạch máu (2.2.3), lượng vắc - xin cấy từ % đến % (phần thể tích) so với mơi trường kiểm tra Nếu vắc - xin dạng đơng khơ phải hồ tan trở lại dung tích ban đầu Ủ mơi trường cấy vắc - xin tủ 37 oC, theo dõi từ ngày đến 10 ngày 4.1.1.2 Nếu vắc - xin có chất diệt trùng giữ mẫu nhiệt độ từ 25 0C đến 30 0C thời gian từ 24 h đến 48 h trước tiến hành kiểm tra Kiểm tra vắc - xin có chất diệt trùng sau: - Cấy mẫu vào ống 10 ml canh thang thịt (2.2.4), theo dõi 37 0C ngày - Cấy chuyển từ ống canh thang thịt sang ống canh thang thịt chuẩn bị, theo dõi 37 0C thời gian từ ngày đến 10 ngày 4.1.2 Đọc kết Mẫu vắc - xin xem đạt tiêu chuẩn khơng có vi sinh vật mọc môi trường kiểm tra thời gian theo dõi 4.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc 4.2.1 Tiến hành 62 Mẫu vắc - xin ria cấy môi trường thạch Sabouraud (2.2.5) sản phẩm thủy phân casein đậu tương (2.2.6) Theo dõi 14 ngày nhiệt độ phòng (từ 20 0C đến 25 0C) 4.2.2 Đọc kết Mẫu vắc - xin xem đạt tiêu chuẩn khơng có tạp khuẩn nấm mốc mọc môi trường kiểm tra thời gian theo dõi 4.3 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma 4.3.1 Tiến hành Mẫu vắc - xin cấy kiểm tra môi trường canh thang PP LO (2.2.7) với nồng độ từ % đến % vắc - xin 100 ml môi trường đĩa thạch PP LO (2.2.8) có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc - xin đĩa Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein (2.2.9), bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua huyết ngựa sử dụng môi trường canh thang tim (2.2.10) bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra Theo dõi môi trường lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 330C đến 370C Tại thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PP LO (2 đĩa) Ủ tủ ấm CO2 (3.2) 370C có % khí CO2, theo dõi 28 ngày 4.3.2 Đọc kết Mẫu vắc - xin xem đạt khơng có khuẩn lạc Mycoplasma mọc môi trường kiểm tra 4.4 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 4.4.1 Tiến hành nuôi cấy Mẫu vắc - xin cấy môi trường kiểm tra, dùng loại môi trường sau: thạch MacConkey (2.2.11), thạch Salmonella-Shigella (2.2.12), thạch Brilliant Green (2.2.13), thạch desoxycholat xitrat (2.2.14) thạch XLD (2.2.15), với nồng độ từ % đến % dung tích mơi trường kiểm tra Ủ môi trường cấy vắc - xin tủ 37 oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau cấy chuyển tiếp sang ống mơi trường nước, dùng loại môi trường sau: canh thang selenit (2.2.16) canh thang tetrathionat (2.2.17) Ủ tủ 37 oC, theo dõi từ 48 h đến 72 h 4.4.2 Đọc kết Mẫu vắc - xin xem đạt khơng có vi khuẩn Salmonella mọc loại môi trường kiểm tra 63 4.5 Kiểm tra có mặt formaldehyt vắc - xin: phương pháp sắt (II) clorua 4.5.1 Tiến hành Pha loãng vắc - xin nồng độ : 200 (phần thể tích) (nếu vắc - xin dạng nhũ dầu pha lỗng nồng độ 1/20) Lấy 0,5 ml vắc - xin pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml formaldehyt chuẩn (2.1.3) pha loãng theo tỉ lệ 1/200 0,5 ml metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua (2.1.1) Đậy nắp ống nghiệm, lắc nhẹ máy lắc (3.5) để đứng ống nghiệm 60 nhiệt độ phịng Sau thêm 1,0 ml sắt (II) clorua axit sulfamic (2.1.2) để đứng ống nghiệm 15 nhiệt độ phòng Đo độ hấp phụ vắc - xin chất chuẩn máy đo quang phổ (3.7) bước sóng 628 nm 4.5.2 Đọc kết Mẫu vắc - xin xem đạt độ hấp thụ đo nhỏ 0,74 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: - Mọi thông tin cần thiết nhận biết đầy đủ mẫu thử; Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; Tất điều kiện thao tác không quy định tiêu chuẩn này, xem tuỳ ý, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết Kết thử nghiệm thu 64 PHỤ LỤC DANH SÁCH TRÌNH TỰ GEN S THAM CHIẾU Năm thu Địa Loại thập Phương mẫu STT Tên chủng PEDV/TN8/2016 2016 PEDV/HY3/2015 2015 Hưng Yên HUA-PED45 2013 Thái Bình KP455313 HUA-PED47 2013 Thái Bình KP455314 HUA-PED55 2014 Quảng Trị KP455315 HUA-PED58 2014 Quảng Trị KP455316 HUA-PED60 2014 Quảng Trị KP455317 HUA-PED63 2014 Quảng Trị KP455318 HUA-PED67 2014 Quảng Trị KP455319 10 HUA-PED86 2015 Hải Phòng KX708902 11 HUA-PED114 2015 Thái Nguyên KX708897 12 HUA-PED118 2015 Vĩnh Phúc KX708899 13 VN_KCHY310113 2013 Hưng Yên KJ960180 14 VN_VAP1113 2013 Việt Nam KJ960179 15 VNJFP1013 2013 Việt Nam KJ960178 16 CV777 Trung Quốc AF353511 17 DR13 Hàn Quốc JQ023162 18 Chinju99 Hàn Quốc AY167585 19 Minnesota135 Mỹ KU982973 2015 Thái Nguyên 65 Accession Number Ruột Nghiên cứu Phân Nghiên cứu PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRANG THIẾT BỊ PHỤC VỤ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Kı́nh hiể n vi soi ngươ ̣c Hê ̣ thố ng tủ sinh ho ̣c và tủ ấ m CO2 Máy ly tâm thường Máy ly tâm lạnh Hê ̣ thố ng máy RT/PCR, điêṇ di DNA 66 ... Giang- Hưng Yên Văn Giang- Hưng Yên Ân Thi- Hưng Yên Ân Thi- Hưng Yên Tiên Lữ- Hưng Yên Tiên Lữ- Hưng Yên Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên – Thái Nguyên. .. nghiên cứu ? ?Phân lập xác định số đặc tính sinh học chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) lợn nuôi Thái Nguyên Hưng Yên? ?? 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Đề tài nghiên cứu với mục tiêu phân lập virus... - Thái Nguyên Đồng Hỷ - Thái Nguyên Phổ Yên - Thái Nguyên Phổ Yên - Thái Nguyên Văn Lâm – Hưng Yên Văn Lâm – Hưng Yên Khoái Châu – Hưng Yên Khoái Châu – Hưng Yên Ân Thi – Hưng Yên Ân Thi – Hưng