Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của virus gây bệnh care

Đất nước đổi mới, kinh tế phát triển kéo theo ngành chăn nuôi phát triển. Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuôi thì chăn nuôi chó cũng trở thành một nghề. Song song với sự gia tăng về số hộ gia đình nuôi chó thì số lượng chó được nuôi trong mỗi hộ cũng tăng lên. Con người nuôi chó với nhiều mục đích khác nhau. Chó được nuôi để giữ nhà, làm bạn trong nhà, làm cảnh, đi săn, chăn cừu, phục vụ cho an ninh quốc phòng…Người ta nuôi chó với mục đích kinh doanh và cung cấp thực phẩm vì thịt chó là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và là đặc sản mà nhiều người ưa chuộng. Có thể nói chó là động vật nuôi trong nhà không thể thiếu của nhiều gia đình từ nông thôn đến thành thị, cả trong nước và ngoài nước. Thực tế cho thấy không chỉ người nước ngoài yêu chó mà rất nhiều người Việt Nam đã coi chó như “đứa con cưng” của họ. Chính vì có rất nhiều người yêu thích và quan tâm đến chó nên số lượng chó tăng lên một cách đáng kể. Thêm vào đó việc mở rộng giao lưu với các nước trên thế giới và việc kinh doanh thú cảnh ngày càng phát triển nên có nhiều giống chó quý đã được nhập vào Việt Nam để nhân giống và kinh doanh. Song song với sự phát triển nhu cầu nuôi chó tăng cả về số lượng và chủng loại dẫn đến nhiều khó khăn làm ảnh hưởng đến hiệu quả việc chăm sóc nuôi dưỡng, đó là tình hình bệnh tật trên đàn chó ngày một phức tạp. Chó là loài ăn thịt, đặc biệt các giống nhập ngoại không quen với môi trường khí hậu nên sức đề kháng kém đòi hỏi một chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, phòng bệnh đặc biệt. Một trong những yếu tố nguy hiểm dẫn đến tình trạng bệnh tật của chó là bệnh do virus gây ra, hay gặp nhất là bệnh Care trên chó. Bệnh phân bố khắp thế giới có tính lây truyền mạnh và gây bệnh toàn thân. Tại Việt Nam đã có những công bố về việc phân lập thành công virus gây bệnh care và đã sản xuất thành công vaccine phòng bệnh care. Tuy nhiên việc phân lập thêm các chủng mới và đang lưu hành hiện nay và với mục tiêu sau khi phân lập được các chủng mới để sản xuất kháng thể care với các chủng mới đang lưu hành. Xuất phát từ những vấn đề trên, dưới sự hướng dẫn tận tình của PGS. TS. Lê Văn Phan và anh chị nhân viên Phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Khoa Thú y Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp tôi thực hiện đề tài:“ Phân Lập Và Xác Định Một Số Đặc Tính Sinh Học Của Virus Gây Bệnh Care ”

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA THÚ Y = = = = = = = = KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS GÂY BỆNH TRÊN CHĨ TRỊNH THỊ BÍCH NGỌC LỚP: TYC-K59 Hà Nội, 8/2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA THÚ Y = = = = = = = = KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE Người thực Lớp Người hướng dẫn Bộ môn : LÊ QUỐC HÒA : K59-TYC : : PGS TS LÊ VĂN PHAN VI SINH VẬT TRUYỀN NHIỄM HÀ NỘI, 12/2018 LỜI CẢM ƠN Trải qua năm học tập rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam, muốn gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giảng viên Khoa Thú Y ln tận tình dạy dỗ, bảo, truyền đạt tâm huyết tới hệ sinh viên kiến thức chuyên môn, kỹ làm việc tư cách đạo đức người Bác sĩ Thú Y giúp tơi hồn thành chương trình đào tạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Văn Phan giảng viên mơn Vi sinh vật- truyền nhiễm, Phó trưởng phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học thú y- Khoa Thú Y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tận tình hướng dẫn bảo dạy dỗ, tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp tơi Bên cạnh tơi muốn bày tỏ biết ơn tới toàn thể anh chị nhân viên Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú Y- Khoa Thú Y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi thực tập làm việc phịng thí nghiệm Với cơng lao khơng nhỏ tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người ln động viên, sát cánh tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên LÊ QUỐC HÒA MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .1 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC TÊN VIẾT TẮT PHẦN I MỞ ĐẦU .7 1.1 Đặt vấn đề .7 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung 2.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu Care giới 2.3 Tình hình nghiên cứu care Việt Nam 12 2.4 Căn bệnh học 13 2.5 Dịch tễ học 15 2.6 Cơ chế gây bệnh 16 2.7 Triệu chứng 20 2.8 Bệnh tích .22 2.9 Chẩn đoán 24 2.10 Điều trị 26 2.11 Phòng bệnh .28 2.12 Tổng quan nuôi cấy tế bào 29 2.12.1 Một số đặc điểm tế bào động vật .30 2.12.2 Một số đặc điểm tế bào Vero DST 30 2.12.3 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào .31 2.12.4 Điều kiện nuôi cấy 33 2.12.5 Sự tạp nhiễm cách hạn chế 33 2.13 Phân lập virus 34 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1 Đối tượng nghiên cứu 36 3.2 Nội dung nghiên cứu 36 3.3 Nguyên vật liệu sử dụng cho nghiên cứu 36 3.3.1 Nguyên liệu 36 3.3.2 Dụng cụ, trang thiết bi thiết bị 36 3.3.3 Hóa chất 36 3.4 Phương pháp nghiên cứu 37 3.4.1 Phương pháp mổ khám thu thập mẫu 37 3.4.2 Phương pháp chẩn đoán kit test nhanh 37 3.4.3 Phương pháp tách chiết RNA 38 3.4.4 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 39 3.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào 41 3.5.6 Phương pháp đếm số lượng tế bào 42 3.4.7 Phương pháp phân lập virus Care tế bào tổ chức .43 3.4.8 Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50) .44 3.4.9 Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus .45 3.4.10 Phương pháp xác định liều gây nhiễm (MOI - Multiplicity of infection) 45 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .47 4.1 Kết thu thập mẫu mẫu 47 4.2 Kết giám định kit test nhanh .48 4.3 Kết mổ khám quan sát bệnh tích 49 4.4 Kết giám định phương pháp RT-PCR 50 4.5 Kết phân lập virus Care môi trường tế bào Vero-DST 52 4.5.1 Kết phục hồi tế bào Vero-DST 52 4.5.2 Kết phân lập virus Care .53 4.5.3 Kết kiểm tra có mặt virus mẫu phân lập phương pháp RT-PCR 56 4.6 Hiệu giá TCID50 khả gây bệnh tích tế bào (CPE) chủng Canine Distemper Virus phân lập 57 4.7 Kết xác định đường cong sinh trưởng 59 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 5.1 Kết luận .62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thông tin cặp mồi sử dụng phản ứng RT-PCR Lan et al (2005) 40 Bảng 4.1 Thông tin mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu 47 Bảng 4.2 Bệnh tích đại thể chó nghi mắc Care 49 Bảng 4.4 Thơng tin thời gian gây bệnh tích chủng virus Care .54 Bảng 4.5 Kết hiệu giá TCID50 chủng virus 57 Bảng 4.6 Kết nghiên cứu khả gây bệnh tích tế bào chủng virus Care 58 Bảng 4.7 Hiệu giá TCID50/25 µl chủng CDV07-P4 tế bào qua thời gian (Log 10) .60 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu trúc virus Care (Nguồn Internet) 15 Hình 3.1 Hình ảnh kit Canine Ditember Virus Antigen (CDV Ag) .39 Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm mẫu phân lập CDV 45 Hình 4.1 Hình ảnh kết chẩn đốn kit test nhanh .49 Hình 4.2 Phổi viêm, gan hóa 51 Hình 4.3 Phổi viêm dính 51 Hình 4.4 Đại não xung huyết 51 Hình 4.5 Hạch lympho sưng, tụ má 51 Hình 4.6 Ruột xuất huyết, căng phồng .51 Hình 4.7 Xuất huyết niêm mạc ruột 51 Hình 4.8: Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR 52 Hình 4.9: Hình ảnh tế bào vero DST sau ni cấy 53 Hình 4.10 CPE CDV07-P gây sau 24 gây nhiễm .56 Hình 4.11 CPE virus vacxin gây sau 24 gây nhiễm 56 Hình 4.12 CPE CDV07-P gây sau 48 gây nhiễm .56 Hình 4.13 CPE CPE virus vacxin gây sau 48 gây nhiễm 56 Hình 4.14 CPE CDV07-P gây sau 72 gây nhiễm .56 Hình 4.15 Đối chứng tế bào sau 72h 56 Hình 4.16 Kết điện di sản phẩm RT-PCR mẫu dịch tế bào .57 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV07-P4 60 DANH MỤC CÁC TÊN VIẾT TẮT Tên viết tắt CDV CDV Ag Tên đầy đủ Canine Distemper Virus Canine Distemper Virus Antigen CPE Cyto Pathogenic Effect CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM DNA ELISA Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Deoxyribonucleic acid Enzyme Linked Immunosorbebp Assay et al And Others FBS Fetal Bovine Serum IHC Immunohistochemistry MOI Multiplicity of Infection MOI Multiplicity of infection PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đất nước đổi mới, kinh tế phát triển kéo theo ngành chăn nuôi phát triển Cùng với phát triển chung ngành chăn ni chăn ni chó trở thành nghề Song song với gia tăng số hộ gia đình ni chó số lượng chó ni hộ tăng lên Con người ni chó với nhiều mục đích khác Chó ni để giữ nhà, làm bạn nhà, làm cảnh, săn, chăn cừu, phục vụ cho an ninh quốc phịng…Người ta ni chó với mục đích kinh doanh cung cấp thực phẩm thịt chó loại thực phẩm giàu dinh dưỡng đặc sản mà nhiều người ưa chuộng Có thể nói chó động vật ni nhà khơng thể thiếu nhiều gia đình từ nơng thơn đến thành thị, nước nước Thực tế cho thấy khơng người nước ngồi u chó mà nhiều người Việt Nam coi chó “đứa cưng” họ Chính có nhiều người u thích quan tâm đến chó nên số lượng chó tăng lên cách đáng kể Thêm vào việc mở rộng giao lưu với nước giới việc kinh doanh thú cảnh ngày phát triển nên có nhiều giống chó quý nhập vào Việt Nam để nhân giống kinh doanh Song song với phát triển nhu cầu ni chó tăng số lượng chủng loại dẫn đến nhiều khó khăn làm ảnh hưởng đến hiệu việc chăm sóc ni dưỡng, tình hình bệnh tật đàn chó ngày phức tạp Chó lồi ăn thịt, đặc biệt giống nhập ngoại không quen với môi trường khí hậu nên sức đề kháng địi hỏi chế độ chăm sóc ni dưỡng, phịng bệnh đặc biệt Một yếu tố nguy hiểm dẫn đến tình trạng bệnh tật chó bệnh virus gây ra, hay gặp bệnh Care chó Bệnh phân bố khắp giới có tính lây truyền mạnh gây bệnh toàn thân Từ mẫu thu thập tiến hành phản ứng RT-PCR Trước tiên, tiến hành tách chiết RNA virus Care theo Kit QIAgen, bước thực theo hướng dẫn Kit Sản phẩm RNA tổng số mẫu nghi bị nhiễm virus Care thu sau tách chiết khuếch đại kỹ thuật RTPCR với tham gia enzym chép ngược (Reverse Transcrip) sử dụng cặp mồi tương ứng với đoạn gen có khả phát virus Care thuộc nhóm Châu Á để tạo đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA) Sau thực 35 chu kỳ phản ứng RT-PCR, sản phẩm khuếch đại máy PCR điện di chụp ảnh M N P Hình 4.8: Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR Chú thích: M: DNA Marker 1kb Plus – Invitrogen; N: Đối chứng âm; P: Đối chứng dương; Giếng 1-8 : Mẫu CDV-01- CDV-08; Kết kiểm tra giám định phương pháp RT-PCR cho thấy kích thước sản phẩm RT-PCR có kích thước tương đồng với đối chứng dương với kích thước theo đoạn mồi thết kế 410 bp Qua hình ảnh cho thấy có mẫu dương tính với CDV 45 4.5 Kết phân lập virus Care môi trường tế bào Vero-DST 4.5.1 Kết phục hồi tế bào Vero-DST Tế bào Vero-DST bảo quản nito lỏng với nhiệt độ - 196°C với mật độ tế bào trước bảo quản 5*10 tế bào/ml Trước tiến hành phân lập cần phục hồi tế bào trước 5-7 ngày để đảm bảo tính sinh trưởng ổn định tế bào Trong q trình ni, mật độ tế bào ln theo dõi thời điểm khác Kết quan sát cho thấy tế bào sau khoảng 4h-6h chuyển vào bình ni cấy bắt đầu bám đáy, sau 24h tế bào vươn dài bám vào bề mặt chai vươn phủ khoảng 60% Tế bào có hình dạng thuôn dài,và nhân giữa, sau 48h tế bào phát bảo phủ toàn bề mặt chai tế bào tiếp tục cấy chuyển sang bình (0h) (4h) (24h) (48h) Hình 4.9: Hình ảnh tế bào vero DST sau ni cấy 4.5.2 Kết phân lập virus Care 46 Từ mẫu thu lựa chọn mẫu từ có biểu triệu chứng điển hình dương tính với test nhanh, có bệnh tích điển hình có kết RT-PCR dương tính với đoạn băng sáng, rõ nét mẫu dương tính lựa chọn để tiến hành phân lập virus Care môi trường tế bào lớp Vero-DST CDV 02, CDV 03, CDV 05, CDV 07 Các mẫu bệnh phẩm phổi, hạch phổi xử lý nghiền thành huyễn dịch, ly lâm lấy dịch lọc qua màng lọc 0.45 µm Sau mẫu gây nhiễm lặp lại lần khay 24 giếng tế bào chuẩn bị sẵn, với thể tích 300µl huyễn dịch giếng Kết phân lập chủng virus Care chó mắc bệnh từ mẫu bệnh phẩm phổi, hạch phổi Quá trình theo dõi bệnh tích tế bào cho thấy tế bào gây nhiễm với mẫu bệnh phẩm xuất bệnh tích tế bào điển hình virus Care (bệnh tích kiểu Syncytium hay thể hợp bào bệnh lý tế bào co cụm lại, hòa màng, bao quanh nhân tế bào bị phá hủy) nhiên thời gian xuất bệnh tích mẫu khác chó khác khơng giống Bệnh tích tế bào xuất từ 24 đến 36 sau gây nhiễm virus Các chủng virus thu lại sau tế bào bị phá hủy 90% - 100% tiến hành thu virus bảo quản -80°C để dùng cho nghiên cứu kiểm tra lại phản ứng RT-PCR tiến hành mổ tả trên.Kết chủng virus Care phân lập thành cơng trình bày Bảng 4.4 Bảng 4.4 Thông tin thời gian gây bệnh tích chủng virus Care 47 STT Mẫu Mẫu phân lập CPE (%) 24hp 36hp 48hp 60hp 72hp Tên virus i i i i i CDV 02 Phổi * 50 100 B B CDV 03 Hạch phổi * 15 40 70 100 CDV 05 Phổi - * 20 65 100 CDV 07 Phổi * 30 50 100 B CDV02P0 CDV03P0 CDV05P0 CDV07- Chú thích: - : chưa có bệnh tích tế bào (CPE) * : CPE 5% 15%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt ni cấy B: Tế bào bong tróc hồn tồn khỏi bề mặt nuôi cấy hpi: hour post inoculation (giờ sau gây nhiễm virus) 48 P0 Hình 4.10 CPE CDV07-P gây sau 24 gây nhiễm Hình 4.11 CPE virus vacxin gây sau 24 gây nhiễm Hình 4.12 CPE CDV07-P gây sau 48 gây nhiễm Hình 4.13 CPE CPE virus vacxin gây sau 48 gây nhiễm Hình 4.14 CPE CDV07-P gây sau 72 gây nhiễm Hình 4.15 Đối chứng tế bào sau 72h 49 4.5.3 Kết kiểm tra có mặt virus mẫu phân lập phương pháp RT-PCR Sau thu chủng virus CDV02-P0, CDV03-P0, CDV05-P0, CDV07-P0 gây bệnh tích tế bào đặc trưng CDV, chủng P0 tiếp chuyển thêm đời liên tiếp môi trường tế bào Vero DST sau dịch virus đời thứ lựa chọn để kiểm tra có mặt CDV Dịch virus thu lại kiểm tra phương pháp RT-PCR lần để giám định lại phát triển nhân lên virus khẳng định biến đổi tế bào Vero DST quan sát CDV gây nên, mà nguyên nhân khác sai sót khâu chuẩn bị, bệnh tích gây virus khác Dịch virus thu sau phân lập tế bào Vero DST lấy để tiến hành tách chiết RNA theo hướng dẫn kit hãng Qiagen Phản ứng RT-PCR thực (theo bước trình bày phần 3.4.3) với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm phản ứng RT- PCR điện di kiểm tra Kết cho thấy mẫu đối chứng âm (N) âm tính, giếng đối chứng dương (P) giếng biểu thị kết mấu CDV02-P CDV03-H CDV05-P, CDV07-P Xuất băng sáng nét, kích thước 410b theo thiết kế Như khăng định bệnh tích tế bào virus phân lập CDV Chú thích: M: DNA Marker 1kb Plus – Invitrogen; M N P N: Đối chứng âm; P: Đối chứng dương; 1: Mẫu CDV02-P3; 2: Mẫu CDV03-P3; 3: Mẫu CDV05-P3; 4: Mẫu CDV07-P3 Hình 4.16 Kết điện di sản phẩm RTPCR mẫu dịch tế bào 50 4.6 Hiệu giá TCID50 khả gây bệnh tích tế bào (CPE) chủng Canine Distemper Virus phân lập Sau phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm tiếp tục cấy chuyển liên tiếp đời tế bào Vero DST, tiếp tục tìm hiểu thêm khả nhân lên mơi trường tế bào hiệu giá TCID 50 chủng virus Care phân lập Đầu tiên tiến hành xác định hiệu giá TCID 50 chủng CDV02, CDV03, CDV05, CDV07 đời P1, P2, P3, P4 theo TCID50 xác định theo phương pháp Reed Muench Kết trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết hiệu giá TCID50 chủng virus Ổn định đặc TCID50/25µl STT Chủng Virus CDV02 Ổn định 6,67x104 CDV03 Ổn định 6,67x105 CDV05 Ổn định 3,16x104 CDV07 Onderstepoort Ổn định 6,67x105 tính ni cấy ( Vacxin) 5.43x105 Kết sau xác định TCID50 chủng CDV02, CDV03, CDV05, CDV07 qua đời P1, P2, P3, P4 có tính ổn định đặc tính ni cấy với hiệu giá TCID50/25µl 6,67x104, 6,67x105, 3,16x104, 6,67x105 Trong nghiên cứu không tiến hành nghiên cứu với virus phân lập mà đồng thời tiến hành chủng virus vacxin Onderstepoort để so sánh khả nhân lên, hủy hoại tế bào chủng Care phân lập với chủng virus vacxin Để đánh giá cách khách quan khả gây bệnh tích tế bào, chủng virus phân lập xác định hiệu giá tính tốn giá trị TCID 50 kết theo bảng bảng 4.5 Sau gây nhiễm môi trường tế bào Vero-DST 51 tỷ lệ MOI 0.01 Kết nghiên cứu khả gây bệnh tích tế bào (CPE) chủng virus Care môi trường tế bào Vero-DST thể bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết nghiên cứu khả gây bệnh tích tế bào chủng virus Care CPE (%) STT Virus 24hp i 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi CDV02 * 50 100 B B B CDV03 - * 15 40 70 B CDV05 - * 20 65 100 B CDV07 * 30 70 100 B B Ond - - * 30 80 B Chú thích: - : chưa có bệnh tích tế bào (CPE) * : CPE 5% 15%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt ni cấy B: Tế bào bong tróc hồn tồn khỏi bề mặt ni cấy hpi: hour post inoculation (giờ sau gây nhiễm virus) Kết qua bảng 4.6, cho thấy virus bắt đầu phá hủy tế bào từ 24 đến 48 sau gây nhiễm phá hủy hoàn toàn tế bào sau 60 đến 72 giờ, nhiên thời gian phá hủy tế bào sớm hay muộn tùy thuộc vào chủng virus, điều phụ thuộc vào khả gây bệnh tích chủng virus khác Các chủng có độc lực cao khả nhân lên tế bào tốt gây bệnh tích tế bào sớm, ngược lại chủng virus độc lực thấp, khả nhân lên tế bào gây bệnh tích muộn Bên cạnh cơng tác lấy mẫu 52 chuẩn bị tiến hành tốt có ý nghĩa quan trọng việc giữ cho virus sống sót bảo tồn độc lực, ngược lại thu thập bảo quản mẫu khơng quy trình làm virus giảm độc lực chết điều ảnh hưởng trực tiếp tới việc phân lập giữ giống virus Phân tích bảng kết 4.6 cho thấy số chủng virus phân lập thành cơng có chủng virus gây bệnh tích tế bào sớm, điền hình phá hủy tế bào hồn tồn giống cơng bố trước đây, biểu thời gian xuất bệnh tích sớm 24h thời gian hủy hoại hoàn toàn tế bào khoảng 48h sau xuất hienj bệnh tích, diễn biến bệnh tích tế bào phát triển nhanh vịng 24h Chủng phân lập từ vaccine có thời gian gây bệnh tích muộn so với chủng phân lập được, thời gian gây bệnh tích chủng vaccine 48h sau gây nhiễm Căn vào khả gây bệnh tích tế bào, khả nhân lên ổn định (là chủng virus nhân lên gây bệnh tích tế bào qua hệ cấy truyền) hiệu giá virus xác định lựa chọn chủng CDV07-P với hiệu giá TCID 50 6,67x105 để nghiên cứu quy luật nhân lên môi trường tế bào DST chủng 4.7 Kết xác định đường cong sinh trưởng Để có nghiên cứu sâu đặc tính sinh học virus tiến hành nghiên cứu quy luật nhân lên virus bên bên tế bào sau gây nhiễm Tế bào Vero –DST sau gây nhiễm virus Care thu riêng rẽ bên bên tế bào theo thời điểm khác từ virus bắt đầu nhân lên tế bào virus phá hủy hoàn toàn tế bào, xác định hiệu giá virus thời điểm thu đường cong sinh trưởng virus đường biểu diễn nhân lên virus Kết nghiên cứu nhân lên chủng CDV07-P4 trình bày bảng 4.7 biểu đồ 4.1 53 Bảng 4.7 Hiệu giá TCID50/25 µl chủng CDV07-P4 tế bào qua thời gian (Log 10) 24hp 36hp 48hp 60hp 72hp 84hp 96hp 108hp Trong tế bào Ngoài tế bào i 0.5 0.83 i 3.16 0.83 i 3.83 1.16 6.16 Log TCID50/25µl 3.16 3.83 0.83 0.5 24hpi 0.83 36hpi 5.87 3.16 2.5 i 6.16 2.5 i 5.87 3.16 i 5.15 2.83 i 3.5 2.5 Trong t ế bào 5.15 2.83 Ngoài t ế bào 3.5 2.5 2.33 1.5 96hpi 108hpi 1.16 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi i 2.33 1.5 Thời điểm thi virus Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV07-P4 Kết nghiên cứu quy luật nhân lên chủng virus CD07-P4 qua bảng 4.7 biểu đồ 4.1 cho thấy thấy hiệu giá virus thường xuyên biến đổi theo thời gian nhân lên virus tế bào Hiệu giá virus tế bào cao tế bào tất thời điểm đạt cao 60 đến 72 sau gây nhiễm điều cho thấy virus phát triển nhanh bên tế bào đạt cao thời điểm Hàm lượng virus bên tế bào thấp nhiều so với bên tế bào hiệu giá virus bên tế bào cao đạt 3.16 TCID50/25µl thấp nhiều so với bên tế bào 6.16 TCID50/25µl.Thời gian cho thấy kết hiệu giá cao thời điểm 60h sau gây nhiễm với hiệu giá lên tới 10 6.16 TCID50/25µl virus tế bào 72h sau gây nhiễm với hệu giá 10 3.16 TCID50/25µl virus tế bào Sau 84h gây nhiễm hiệu giá virus giảm mạnh so với hiệu giá thời điểm 54 virus đạt hàm lượng cao Qua biểu đồ xác định thời gian thích hợp để thu virus 60-72h sau gây nhiễm So sánh với bảng 4.6 ta thấy thời điểm 60 h sau gây nhiễm thời điểm bệnh tích tế bào đạt cực đại 100% thời điểm cho hiệu giá TCID 50 cao so với thời điểm khác Và lúc virus chưa làm phá vỡ tế bào nên hiệu giá TCID50 dịch nuôi cấy chưa đạt cực đại, sau 72h tế bào bắt đầu bị phá hủy bong khỏi mặt nuôi cấy, virus giải phóng hàm lượng virus dịch ni cấy đạt cao làm 103.16 TCID50/25µl 55 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Trong số mẫu thu thập phương pháp RT-PCR xác định mẫu CDV-01, CDV-02, CDV-03, CDV-05, CDV-06, CDV-07, CDV08 dương tính với virus care - Đã phân lập thành công chủng virus care ký hiệu CDV 02, CDV 03, CDV 05, CDV 07 - Hiệu giá virus chủng CDV02, CDV03, CDV05, CDV07 sau đời cấy chuyển môi trường tế bào 6,67x10 4, 6,67x105, 3,16x104, 6,67x105 TCID50/25µl - Đối với chủng CDV07-P4 hàm lượng virus đạt cao sau 48h gây nhiễm với hiệu giá 103.16 TCID50/25µl Và thời gian thích hợp để thu virus 60-72h sau gây nhiễm - Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng chủng virus CPV07-P4 cho thấy hàm lượng virus đạt cao sau 60h gây nhiếm, hiệu giá virus đạt 106.16 TCID50/25µl 5.2 Kiến nghị Giải trình tự gen để so sánh mức độ tương đồng chủng lưu hành với chủng phân lập trước 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Vĩnh Phước Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc NXB Nơng Nghiệp Đặng VănChung (1977) Bệnh học nội khoa tập NXB Y học Hà Nội, tr 58-62 Trần Thanh Phong., & et al (1996 ) Một số bệnh truyền nhiễm chó Tủ sách trường Đại học Nơng lâm thành phồ Hồ Chí Minh, tr 54-68 Thị Kim Ngân Phan, & Ngọc Thanh Trần (2002) Thực tiêu sinh sản tế bào thực vật Ủy ban nhân dân tỉnh an Giang Trường đại học An Giang Vương Đức Chất, & Lê Thị Tài (2004) Bệnh chó mèo cách phịng trị NXB Nông Nghiệp Tô Du (2006) Kỹ thuật nuôi chó mèo phịng trị bệnh thường gặp NXB Lao động xã hội Nguyễn Văn Thanh (2007 ) Bài giảng Bệnh chó mèo Nguyễn Thị Lan, Bounheuang SIHOUNGVANH, Nguyễn Thị Yến, & Nguyễn Hữu Nam (2014) Một số đặc điểm bệnh lý chó gây bệnh thực nghiệm chủng virus care (CDV-768) Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, tập 13, số 1, 56-64 Nguyễn Văn Thanh, & Sử Thanh Long Vũ Như Quán, Nguyễn Đức Trường (2016) Bệnh chó Việt Nam biện pháp phịng trị NXB Nơng nghiệp Hà Nội Tài liệu nước 10 Max JG %J Journal of General Virology Appel (1978) Reversion to virulence of attenuated canine distemper virus in vivo and in vitro 41(2), 385-393 11 Sumumme (1987) Demyelination in canine distemper encephalomyelitis: an ultrastructural analysis 16(6), 871-881 57 12 Max JG Appel, Susan Pearce-Kelling, & Brian A %J Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Summers (1992) Dog lymphocyte cultures facilitate the isolation and growth of virulent canine distemper virus 4(3), 258-263 13 Merete Blixenkrone-Møller, Vilhjalmur Svansson, Per Have, Claes Örvell, Max Appel, Ib Rode Pedersen, Per %J Veterinary microbiology Henriksen (1993) Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population 37(1-2), 163-173 14 Chieko KAI, Fumiko OCHIKUBO, Masatsugu OKITA, Tetsuo IINUMA, Takeshi MIKAMI, Fumio KOBUNE, & Kazuya %J Journal of Veterinary Medical Science YAMANOUCHI (1993) Use of B95a cells for isolation of canine distemper virus from clinical cases 55(6), 1067-1070 15 Simpson, JW, Maskell, IE, & Markwell (1994) Use of a restricted antigen diet in the management of idiopathic canine colitis 35(5), 233-238 16 Chappuis (1995) Control of canine distemper 44(2-4), 351-358 17 L Haas, W Martens, I Greiser-Wilke, L Mamaev, T Butina, D Maack, & T %J Virus research Barrett (1997) Analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany 48(2), 165-171 18 Roger K Maes, Annabel G Wise, Scott D Fitzgerald, Albert Ramudo, Joseph Kline, Aivars Vilnis, & Cherie %J Journal of veterinary diagnostic investigation Benson (2003) A canine distemper outbreak in Alaska: diagnosis and strain characterization using sequence analysis 15(3), 213220 19 Nawawan Anansuchatgul, Raweewan Buasri, Ratchaneekorn Chencharoen, Sumittra Watanodorn, Juthatip Keawcharoen, & Kanisak %J The Thai Journal of Veterinary Medicine Oraveerakul (2005) The detection of 58 canine distemper virus by a nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction in blood samples collected after vaccination 35(4), 35-43 20 Ron Hines DVM PhD (2006) Canine Distemper In Your Pet 21 NT Lan, R Yamaguchi, A Inomata, Y Furuya, K Uchida, S Sugano, & S %J Veterinary microbiology Tateyama (2006) Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs 115(1-3), 32-42 22 D Latha, SR Srinivasan, PS Thirunavukkarasu, L Gunaselan, P Ramadass, & RB Narayanan (2007) Assessment of canine distemper virus infection in vaccinated and unvaccinated dogs 23 Dong-Jun An, Sook-Hee Yoon, Jee-Yong Park, In-Sun No, & Bong-Kyun %J Veterinary microbiology Park (2008) Phylogenetic characterization of canine distemper virus isolates from naturally infected dogs and a marten in Korea 132(3-4), 389-395 24 Nguyen Thi Lan, Ryoji Yamaguchi, Tran Trung Kien, Takuya Hirai, Yuichi Hidaka, & Nguyen Huu Nam (2009) First Isolation and Characterization of Canine Distemper Virus in Vietnam with the Immunohistochemical Examination of the Dog Journal of Veterinary Medical Science, 71(2), 155-162 doi:10.1292/jvms.71.155 25 Veljko M Nikolin, Wibbelt, Gudrun (2012) Susceptibility of carnivore hosts to strains of canine distemper virus from distinct genetic lineages 156(12), 45-53 26 David T.Smith (1979) Zinser’s Text book of Bacteriology 808-810 27 Paul Shabram, & Estuardo Aguilar-Cordova (2000) Multiplicity of infection/multiplicity of confusion Molecular Therapy, 2(5), 420-421 28 Judith Butler (2004) Undoing gender: routledge 59 ... Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp thực đề tài:“ Phân Lập Và Xác Định Một Số Đặc Tính Sinh Học Của Virus Gây Bệnh Care ” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài  Phân lập Canine Distemper Virus. .. Vero DST  Xác định số đặc tính sinh học chủng virus Parvovirus phân lập được:  Xác định hiệu giá (TCID50) phương pháp Spearman-Karber;  Xác định đường cong sinh trưởng chủng CDV phân lập PHẦN...HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA THÚ Y = = = = = = = = KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE Người thực Lớp