Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú (epinephelus spp)

Bộ GIáO DụC Và đào TạO TR-ờng đại học vinh ngun thÞ vui PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ (Epinephelus spp.) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SỸ CHUN NGÀNH NI TRỒNG THỦY SẢN NghƯ An - 2012 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Cô giáo TS Phạm Thị Tâm, người định hướng nghiên cứu đề tài hướng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới hỗ trợ tài phương pháp từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15 Tôi xin cảm ơn tập thể cán Khoa Nông Lâm Ngư, Trung tâm THTN, Khoa Sau đại học Trường Đại học Vinh đặc biệt tập thể cán bộ, học viên sinh viên Viện Đại học Mở Hà Nội, chia sẻ khó khăn giúp tơi triển khai nội dung đề tài Cuối xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo, gia đình bạn bè động viên nhiệt tình ủng hộ để tơi hồn thành khóa học Nghệ An, ngày 10 tháng 10 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Vui ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học cá mú 1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.2 Tình hình dịch bệnh cá mú giới Việt Nam 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Một số nghiên cứu bệnh Virus cá mú 10 1.3.1 Trên giới 10 1.3.2 Tại Việt Nam 12 1.4 Một số đặc điểm sinh học virus NNV 14 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 20 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp phân lập virus 20 2.2.2 Phương pháp tách dòng gen 25 2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 27 2.2.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh học NNV 28 2.4 Phương pháp xử lý số liệu, đánh giá, so sánh 31 iii 2.5 Địa điểm thời gian nghiên cứu 31 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết phân lập virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú 32 3.1.1 Kết sàng lọc mẫu nhiễm virus gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp mô bệnh học 32 3.1.2 Kết sàng lọc mẫu nhiễm virus gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR 34 3.1.3 Kết phân lập virus tế bào mẫn cảm 35 3.1.4 Kết xác định lồi dựa trình tự gen mã hóa kháng ngun NNV phân lập 37 3.2 Kết xác định đặc tính sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) 45 3.2.1 Đặc tính gây bệnh virus nồng độ pha loãng 45 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh virus 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 53 PHỤ LỤC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ký Chữ đầy đủ hiệu Cytopathic Effect CPE Fetal bovine serum FBS Grouper cell line GF-1 Hematoxylin Eosin H&E Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific NACA Office International de Epizooties OIE Polymerase Chain Reaction PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR Striped Snakehead cell line SSN-1 Tissue Culture Infectious Dose TCID Viral Encephalopathy and Retinopathy VER Viral Nervous Necrosis VNN Necrosis Nervous Viral NNV Epinephelus E Barfin flounder nervous necrosis virus BFNNV Redspotted grouper nervous necrosis virus RGNNV Striped jack nervous necrosis virus SJNNV Tiger puffer nervous necrosis virus TPNNV Grouper nervous necrosis virus GNNV Greasy grouper nervous necrosis virus GGNNV Indirect flounder nervous system IFAT Immunohistochemistry IHC Central nervous system CNS Leibovitz 15 v L – 50 Foetal calf serum FCS Hank’s blance salt solution HBSS Grouper spleen GS 50% Tissue culture infective dose TCID50 Open readinh flame ORF RNA depending RNA polymerase RdRp Cộng tác viên Ctv Tế bào TB Biểu bệnh BHB vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết kiểm tra virus phương pháp mô bệnh học 33 Bảng 3.2 Kết kiểm tra virus gây bệnh hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR 34 Bảng 3.3 Kết phân lập virus tế bào GS 01 36 Bảng 3.4 So sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn gen T2 thu với trình tự GeneBank 43 Bảng 3.5 Kết xác định khả gây bệnh NNV tế bào GS1 46 Bảng 3.6 Kết gây nhiễm NNV ấu trùng cá mú 47 Bảng 3.7 Khả gây bệnh VR cá mú 28oC ngày 50 Bảng 3.8 Khả gây bệnh VR cá mú 28oC ngày 24oCđêm 50 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo Nervous Necrosis Virus 15 Hình 1.2 Cấu trúc genome Nervous Necrosis Virus 16 Hình 3.1 Bệnh tích tế bào mô não mô mắt cá 32 Hình 3.2 Bệnh tích tế bào GS1 sau gây nhiễm NNV 35 Hình 3.3 Mức độ CPE tế bào GS1 gây nhiễm NNV 36 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra RNA tổng số gel agarose 1% 37 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 1% 38 Hình 3.6 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α 40 Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme EcoRI 41 Hình 3.8 Kết tinh DNA plasmid tái tổ hợp 42 Hình 3.9 Mật độ tế bào sống sót sau gây nhiễm NNV 49 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra ấu trùng cá thí nghiệm 51 viii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam có điều kiện địa lý khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có bờ biển dài 3260km, 12 đầm phá eo vịnh, 112 cửa lạch có 600.000 vùng triều Đó điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nghề biển nói chung nghề ni trồng thuỷ sản nói riêng Ngành thủy sản năm gần phát triển nhanh chóng, dần khẳng định vị trí trở thành ngành kinh tế mũi nhọn giới Việt Nam, với kim ngạch xuất nông, lâm, thuỷ sản theo thống kê Bộ NN&PTNT tháng năm 2012 đạt 20,4 tỷ USD Trong nghề nuôi cá biển đánh giá nghề mang lại hiệu kinh tế cao cá mú xem số đối tượng chủ lực Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế cao hàm lượng dinh dưỡng giàu axit béo không no Thịt cá thơm ngon bổ dưỡng cá mú thị trường nước ưa chuộng Có thể nói cá mú đối tượng nuôi hấp dẫn với nhiều người dân vùng biển Tuy mang lại hiệu kinh tế cao cá mú lại dễ nhiễm bệnh, tỷ lệ chết cao Qua số nghiên cứu tác nhân gây bệnh chủ yếu cá mú thường virus, nấm vi khuẩn nguy hiểm bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrocis - VNN) hay bệnh não võng mạc (VER-Viral Encephalopathy) Betanodavirus gây Virus cơng gây bệnh cá mú tất giai đoạn phát triển song bệnh thường gặp nhiều gây tác hại lớn giai đoạn từ ấu trùng đến cá giống (10 - 45 ngày tuổi) Khi bị bệnh cá có biểu rối loạn thần kinh thăng bằng, bơi xoay tròn, bơi không định hướng, đầu chúc xuống treo mặt nước nằm đáy bể, đáy lồng Cá bệnh chết sau - ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% Ở Việt Nam, bệnh phân bố hầu hết vùng nuôi nước Mùa vụ xuất bệnh từ tháng đến tháng 10 đặc biệt nhiệt độ nước cao (25-30ºC) Như để góp phần nâng cao hiệu nghề ni cá mú phịng, chữa bệnh hoại tử thần kinh cho cá, đặc tính virus gây bệnh cần xem xét, nghiên cứu để đưa giải pháp hữu hiệu, bệnh hoại tử thần kinh virut gây Chính vậy, cho phép Khoa Sau đại học, Trường Đại hoc Vinh với hỗ trợ đề tài cấp nhà nước, mã số: KC04.03/11-15 ,Khoa công nghệ sinh học Viện Đại học mở Hà Nội thực đề tài: ―Phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú (Epinephelus spp.)” Mục tiêu đề tài Đề tài thực với mục tiêu sau: - Phân lập (Necrosis Nervous Viral NNV) gây bệnh cho cá mú - Xác định số đặc tính sinh học virus NNV làm tiền đề xác định dịch tễ bệnh, phòng bệnh Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu trên, đề tài triển khai nội dung nghiên cứu sau: - Phân lập virus từ cá mú tự nhiên có biểu bệnh hoại tử thần kinh - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Hình 3.9 Mật độ tế bào sống sót sau gây nhiễm NNV Mật độ tế bào sống sót tỷ lệ nghịch với khả gây nhiễm NNV, kết trình bày đồ thị cho thấy, 220C nhiệt độ phù hợp cho nhân lên gây nhiễm tế bào GS1 Tại thời điểm bắt đầu gây nhiễm virus, mật độ tế bào sống giếng nuôi cấy 22x102 tế bào/mm2 tất lơ thí nghiệm, sau giá trị giảm nhanh chóng kể từ ngày thứ đạt thấp ngày thứ trình theo dõi Tỷ lệ tế bào sống sót giếng ni nhiệt độ 220C sau ngày đạt 0,7x102 tế bào/mm2 thấp 9-10 lần so với tế bào nuôi nhiệt độ 17, 27 32oC Như vậy, virus thích nghi nhân lên tốt tế bào GS1 nuôi cấy 220C 3.2.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả gây bệnh virus ấu trùng cá mú Theo tác giả Chi cộng sự, 1999, khả nhiễm bệnh hoại tử thần kinh cá mú phụ thuộc nhiều vào yếu tố nhiệt độ, đồng thời với việc đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây nhiễm NNV tế bào mẫn cảm, chúng tơi thực thí nghiệm gây nhiễm NNV vào cá mú điều kiện nhiệt độ là: 280C (cả ngày) 280 (ban ngày), 240C (ban đêm) Mức độ gây nhiễm xác định phản ứng PCR phát vùng gen đặc hiệu T2 NNV nhằm chứng minh có mặt virus cá thí nghiệm 49 Bảng 3.6 Khả gây bệnh VR cá mú 28oC ngày Chủng QN4 KH4 Tỷ lệ chết (%) theo thời gian gây nhiễm (h) 270 24 50 80 Xuất gen T2 NNV theo thời gian gây nhiễm (h) 10 20 30 50 NNV + + + + ĐC - - - - NNV + + + + ĐC - - - - 80 - - - - 80 100 0 68 100 0 5 Kết bảng 3.6 cho thấy: lô ấu trùng cá gây nhiễm NNV chủng QN4 ni nhiệt độ trì 280C ngày có tỷ lệ chết tích lũy 80% sau ngày, tiếp tục theo dõi đến 50 giờ, tỷ lệ lên tới 100% Trong đó, điều kiện này, tỷ lệ ấu trùng chết lô đối chứng 5% 80 theo dõi Qua thí nghiệm cho thấy lô ấu trùng cá gây nhiễm NNV chủng KH4 có tỷ lệ chết tích lũy 68% sau ngày, theo dõi đến 50 giờ, tỷ lệ lên tới 100% Trong điều kiện nhiệt độ lô đối chứng tỷ lệ chết 5% sau 50 theo dõi Chúng tiếp tục bố trí thí nghiệm 28oC vào ban ngày 24oC vào ban đêm để xác định mức độ gây bệnh ấu trùng cá mú Kết thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Khả gây bệnh VR cá mú 28oC ngày 24oCđêm Chủng QN4 KH4 Xuất gen T2 NNV theo thời gian gây nhiễm (h) 10 20 30 50 NNV - + + + ĐC NNV - + + + ĐC Ghi chú: +: có gen T2 80 + + - 50 270 Tỷ lệ chết (%) theo thời gian gây nhiễm (h) 24 50 10 60 0 30 60 0 -: khơng có genT2 80 100 10 100 Kết thí nghiệm điều kiện nước 280C vào ban ngày 240C vào ban đêm, tỷ lệ chết tích lũy ấu trùng sau gây nhiễm NNV chủng QN4 10% sau ngày theo dõi tăng lên 60% sau 50 giờ, đến 80 tỷ lệ lên tới 100% Với chủng KH4 tỷ lệ chết tích lũy ấu trùng sau gây nhiễm NNV 30% sau ngày nhiên sau 50 tỷ lệ chết tăng lên 60% gây chết hồn tồn sau 80 lơ đối chứng sau 80 theo dõi thí nghiệm tỷ lệ chết 5% Như so với điều kiện nước nuôi 280C ngày, ấu trùng cá lô nhiệt độ biến đổi chết chậm hơn, nhiên lô đối chứng có tỷ lệ chết cao so với lơ ổn nhiệt Kiểm tra có mặt NNV ấu trùng cá gây nhiễm phản ứng PCR cho thấy: từ 10 virus xâm nhập vào cá tồn suốt thời gian thí nghiệm (đến 270 giờ) (hình 3) Lơ đối chứng âm, cá chết không phát thấy gen T2 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra ấu trùng cá thí nghiệm M: Thang DNA chuẩn; giếng 1-3, 4-6 sản phẩm PCR kiểm tra ấu trùngs sau gây nhiễm 10, 20, 30, 50, 80, 270 giờ; giếng 7,8,9 sản phẩm PCR mẫu đối chứng âm 50, 80, 270 Theo Mori cs (1991), Fukuda cs (1996), Le Breton cs (1997), bệnh hoại tử thần kinh (VNN) thường xảy cá mú vào mùa hè, 51 nhiệt độ nước khoảng 25- 280C, nhiên, nhiệt độ xuống thấp 230C tỷ lệ cá chết nhiễm bệnh giảm đáng kể Tại Đài Loan, NNV thường gây bệnh vào khoảng thời gian từ tháng đến tháng 9, đó, thời gian gây chết nhiều từ tháng 6-8 nhiệt độ nước dao động từ 30320C Từ tháng 10 trở đi, tỷ lệ cá chết giảm hẳn kiểm tra phản ứng PCR phát thấy gen T2, điều chứng tỏ, nhiệt độ giảm, cá mang trùng không gây tượng hoại tử tổ chức khơng gây chết cá nhiễm bệnh Như vậy, nhiệt độ yếu tố có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ chết nhiễm NNV, kết thí nghiệm bảng sở để giải thích tượng tỷ lệ chết cá mú thường tập trung chủ yếu vào tháng 46 Việt Nam 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua phân lập virus phương pháp mô bệnh học xác định 27 mẫu cá xuất không bào (thể vùi) virus gây hoại tử thần kinh mô mắt mô não Phân lập virus phương pháp RT- PCR xác định 26 mẫu có xuất đoạn gen đặc hiệu virus gây hoại tử thần kinh gen T2 cấu trúc ARN2 Kết phân lập virus tế bào mẫn cảm (GS1)được nuôi cấy nhiệt độ 220C Đã xác định hiệu giá TCID50 tế bào GS1 26 chủng virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú, mức độ gây bệnh tích tế bào chủng khác Virus thích nghi nhân lên tốt tế bào GS01 Nhiệt độ yếu tố có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ chết nhiễn NNV Như yếu tố nhiệt độ sở giải thích tượng cá mú chết tỷ lệ chủ yếu vào tháng – Việt nam KIẾN NGHỊ - Tiếp tục phân lập virus để tạo nguyên liệu cho nghiên cứu xác định hiệu giá để xác định mức độ gây bệnh chủng - Tiếp tục nghiên cứu đặc tính sinh học làm sở xác định dịch tễ bệnh hoại tử thần kinh PHỤ LỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Phạm Thị Tâm, Phạm Cơng Hoạt, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Quang Linh (2012) Nghiên cứu khả gây bệnh gây đáp 53 ứng miễn dịch virus gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) cá mú nuôi Việt Nam Tạp chí KHKT Thú y số Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Quang Linh (2012) Xác định viruts gây bệnh hoại tử thân kinh chình ni vùng biển Miền Trung, Khoa học cơng nghệ tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn kỳ 1, tháng năm 2012 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Bộ thủy sản, 2001 Tình hình ni thủy sản biển biện pháp phát triển nuôi biển thời gian tới, Hà Nội, tháng 11/2001 [2] Bộ thuỷ sản, 2004 Hiện trạng nuôi cá song Cát Bà Tạp chí tơm, số 102, 07/2004 [3] Bùi Quang Tề ctv, 2003 Chấn đốn phịng trị số bệnh truyền nhiễm cá nuôi lồng thủy đặc sản Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học ngành thủy sản 1996-2000 Bộ thủy sản, HN 2003 [4] Đồn Văn Đẩu, 1998 Một số vấn đề tính bền vững q trình phát triển ni ngao, cua nuôi cá lồng biển nớc ta Tuyển tập báo cáo khoa học toàn quốc NTTS 09/1998 [5] Đào Mạnh Sơn, Đỗ Văn Nguyên, 2000 Đặc điểm sinh học sản xuất giống cá Song (Epinephelus spp) miền Bắc - Việt Nam Tuyển tập cơng trình nghiên cứu nghề cá biển tập 1, 1996-2000 [6] Đinh Đoàn Long – Cơ sở di truyền học phân tử tế bào.Nxb KHKT, Hà Nội,2008 [7] Nguyễn Ngọc Du, Lê Hữu Tài, Cao Thành Trung, Phạm Võ Ngọc Ánh, Trương Hồng Việt - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Bệnh thường gặp cá mú nuôi Vũng Tàu http://longdinh.com/ [8] Phạm Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh (2004) Những dấu hiệu mô bệnh học VNN cá song chấm nâu Epinephelus coioides Hải Phòng Nghệ An [9] Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên – Khoa nuôi trồng Thuỷ sản-ĐH Nha Trang (2008) Bệnh hoại tử thần kinh cá biển ni Khánh Hồ [10] Trần Văn Hích, Phạm Thị Duyên Bệnh hoại tử thần kinh cá biển ni Khánh Hịa [11] Tạp chí thủy sản 09/2012 55 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [12] A Hegde, C.L Chen, Q.W Qin, T.J Lama, Y.M Sin Aquaculture 213 (2002) 55–72 [13] Chiara Maltese and Giuseppe Bovo (2007) Viral encephalopathy and retinopathy [14] Chi S.C (1997) Mass mortalities associated with viral nervous necrosis (VNN) disease in two species of hatchery-reared grouper, Epinephelus fuscogutatus and Epinephelus akaara [15] Chi S.C (2001) Characterization of grouper nervous necrosis virus (GNNV) [16] Chin-Chiu Lin, John Han-You Lin, Ming-Shyan Chen, Huey-Lang Yang⁎An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper (Epinephelus coioides) Aquaculture 268 (2007) 265–273 [17] Chi S C., J R Shieh, S J Lin Genetic and antigenic analysis of betanodaviruses isolated from aquatic organisms in Taiwan DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Vol 55: 221–228, 2003 [18] Disease strategy Viral encephalopathy and retinopathy (2004) [19] Eirik Biering1, Knut Falk, Eirik Hoe, Jegatheswaran Thevarajan, Maaike Joerink, Are Nylund, Curt Endresen, Bjørn Krossøy1, Segment encodes a structural protein of infectious salmon anaemia virus (IS AV); the colinear transcript from Segment probably encodes a non-structural or minor structural protein DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Vol 49: 117– 122, 2002 [20] Danayadol, Y Kanchanakhan, S., Roonkamnertwongsa, 2002 S A virological survey in diseased grouper in Thailand using virus isolation and polymerase chain reaction (PCR) technique Book of Abstracts 5th Symposium on Diseases in Asia Aquaculture, 24-28 November 2002 Gold Coast, Australia p 53 [21] Lin, L., He, J., Mori, K.I., Nishioka, T., Wu, J.T., Weng, S., Mudhiake, K., Arimoto M and Nakai, T 2001 Mass mortalities associated with viral 56 nervous necrosis in hatchery-reared groupers in the People’s Republic of China Fish Pathology 36, 186-188 [22] Lin, C.S., Lu, M.W., Tang, L., Liu, W., Chao, C.B., Lin, C.J., Krishna, N.K., Johnson, J.E and Schneemann, A 2001 Characterization of virus-like particles assembled in a recombinant baculovirus system expressing the capsid protein of a fish nodavirus Journal of Virology290, 50-58 [23] Lee K W., S C Chi and T M Cheng Interference of the life cycle of fish nodavirus with fishretrovirus Journal of General Virology (2002), 83, 2469–2474 [24] Mitchell, Richard Sheppard; Kumar, Vinay; Abbas, Abul K.; Fausto, Nelson.(2004) Robbins Basic Pathology Philadelphia: Saunders ISBN 14160-2973-7 8th edition [25] Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY.) [26] Ming-Wei Lu (2003) Infection competition against grouper nervous necrosis virus by virus – like particles produced in Escherichia coli [27] Ming-Wei Lu, Wangta Liu and Chan-Shing Lin Infection competition against grouper nervous necrosis virus by virus-like particles produced in Escherichia coli Journal of General Virology (2003), 84, 1577–1582 [28] Mori, K., Nakai, T., Muroga, K., Arimoto, M., Mushiake, K & Furusawa, I (1992) Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in [29] Mori K., T Mangyoku , T Iwamoto , M Arimoto , S Tanaka , T Nakai Serological relationships among genotypic variant of betanodavirus DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Vol 57: 19–26, 2003 [30] Mori K (2003) Serological relationships among genotypic variants of betanodavirus [31] Office international des epizooties (2009) Manual of diagnostic test for aquatic animals [32] Toyohiko Nishizawa (1995) Comparison of the coat protein genes of five fish nodavirus, the causative agents of viral nervous necrosis in marine fish 57 [33] Roy P.E Yanong - University of Florida (2010) Viral nervous necrosis (betanodavirus) infections in fish [34] Reed, L.J.; Muench, H (1938) "A simple method of estimating fifty percent endpoints" The American Journal of Hygiene 27: 493–497 [35] Thie ´ry, J Cozien, J Cabon, F Lamour, M Baud and A Schneemann2 Induction of a Protective Immune Response against Viral Nervous Necrosis in the European Sea Bass Dicentrarchus labrax by Using Betanodavirus Virus-Like Particles JOURNAL OF VIROLOGY, Oct 2006, Vol 80, No 20 p 10201–10207 [36] Yi-Da Wang (2009) Inactivation of nervous necrosis virus infecting grouper (Epinephelus coioides) by epinecidin-1 and hepcidin 1-5 antimicrobial peptides, and downregulation of Mx2 and Mx3 gene expressions [37] Q.W Qin, T.H Wu, T.L Jia, A.Hegde, R.Q Zhang Journal of Virological Methods 131 (2006) 58–64) [38] Sambrook J, Russel DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY.) [39] Yu-Hsuan Kai, Shau Chi Chi Efficacies of inactivated vaccines against betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus coioides) by bath immunization Vaccine (2008) 26, 1450—145 [40] Yi-Da Wang, Chun-Wei Kung, Shau-Chi Chi, Jyh-Yih Chen Inactivation of nervous necrosis virus infecting grouper (Epinephelus coioides by epinecidin-1 and hepcidin 1–5 antimicrobial peptide and downregulation of Mx2 and Mx3 gene expression Fish & Shellfish Immunology xxx (2009) 1–8 [41] Shau-Chi Chi (1999) Temperature effect on nervous necrosis virus infection in grouper cell line and grouper larve [42] Sambrook J, Russel DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY.) pháp [Reed-Muench, 1938] 58 PHỤ LỤC Bảng Kết kiểm tra mô não mắt cá mú nghi nhiễm NNV STT Ký hiệu mẫu Não Mắt Biểu lâm sàng QN1 _ _ AB QN2 + _ AB QN3 _ _ AB QN4 +++ +++ ABCD QN5 _ _ AB QN6 _ _ AB QN7 +++ ++ ABCD QN8 _ _ AB HP1 _ _ AB 10 HP2 + _ AB 11 HP3 _ _ AB 12 HP4 +++ +++ ABCD 13 HP5 +++ +++ ABCD 14 HP6 _ _ AB 15 HP7 _ _ AB 16 HP8 +++ +++ ABCD 17 HP9 _ _ AB 18 HP10 + _ AB 19 HP11 _ _ AB 20 NĐ1 +++ +++ ABC D 21 NĐ2 _ _ AB 22 NĐ3 + _ AB 23 NĐ4 +++ +++ ABCD 24 NĐ5 +++ +++ ABCD 25 NĐ6 _ _ AB 26 NĐ7 + _ AB 27 NĐ8 + _ AB 28 NĐ9 _ _ AB 29 NĐ10 +++ +++ ABCD 30 NĐ11 +++ +++ ABCD 31 KH1 _ _ AB 32 KH2 _ _ AB 33 KH3 _ _ AB 34 KH4 +++ ++ ABCD 35 KH5 _ _ AB 36 KH6 + _ AB 37 KH7 +++ +++ ABCD 38 KH8 _ _ AB 39 KH9 + _ AB 40 BT1 + _ AB 41 BT2 +++ +++ ABCD 42 BT3 _ _ AB 43 BT4 +++ +++ ABCD 44 BT5 _ _ AB 45 BT6 _ _ AB 46 BT7 + _ AB 47 BT8 _ _ AB 48 BT9 +++ +++ ABCD 49 BT10 _ _ AB 50 BT11 _ _ AB 51 BT12 +++ ++ ABCD Ghi chú: A: Bơi bất thường; B: Da biến sắc; C: Sưng bóng hơi; D: Xung huyết não +++: Khơng bào dày đặc não, kích thước không bào lớn, ++: khoảng 30-50 không Bảng Kết kiểm tra có mặt gen T2 cấu trúc ARN NNV STT Ký hiệu mẫu T2 RNA2 QN1 _ _ QN2 + + QN3 _ _ QN4 + + QN5 _ _ QN6 _ _ QN7 - - QN8 _ _ HP1 _ _ 10 HP2 + + 11 HP3 - - 12 HP4 + + 13 HP5 - - 14 HP6 + + 15 HP7 + + 16 HP8 + + 17 HP9 _ _ 18 HP10 + + 19 HP11 + + 20 NĐ1 + + 21 NĐ2 _ _ 22 NĐ3 + + 23 NĐ4 + + 24 NĐ5 + + 25 NĐ6 _ _ 26 NĐ7 + + 27 NĐ8 + + 28 NĐ9 _ _ 29 NĐ10 + + 30 NĐ11 + + 31 KH1 _ _ 32 KH2 _ _ 33 KH3 _ _ 34 KH4 + + 35 KH5 _ _ 36 KH6 - - 37 KH7 + + 38 KH8 _ _ 39 KH9 + + 40 BT1 - - 41 BT2 + + 42 BT3 + + 43 BT4 + + 44 BT5 _ _ 45 BT6 _ _ 46 BT7 + + 47 BT8 _ _ 48 BT9 + + 49 BT10 + + 50 BT11 _ _ 51 BT12 + + Bảng Kết phân lập virus tế bào GS 01 STT CPE Ký hiệu mẫu 24h 48h 72h 96h 120h 144h 7d 10d ++++ QN2 _ _ + + + ++ ++ QN4 _ + + + ++ +++ ++++ HP2 _ _ + + + ++ ++ HP4 _ + + + ++ +++ ++++ HP6 _ _ + + + ++ ++ HP7 _ + + + ++ +++ ++++ HP8 _ + + + ++ +++ ++++ HP10 _ _ + + + ++ ++ HP11 _ _ _ _ _ _ _ 10 NĐ1 _ + + + ++ +++ ++++ 11 NĐ3 _ _ + + + ++ ++ 12 NĐ4 _ + + + ++ +++ ++++ 13 NĐ5 _ + + + ++ +++ ++++ 14 NĐ7 _ _ + + + ++ ++ 15 NĐ8 _ + + + ++ +++ ++++ 16 NĐ10 _ _ + + + ++ ++ ++++ 17 NĐ11 _ _ + + + ++ ++ +++ 18 KH4 _ + + + ++ +++ ++++ 19 KH7 _ _ + + + ++ ++ 20 KH9 _ _ + + + ++ ++ 21 BT2 _ _ + + + ++ ++++ 22 BT3 _ + + + ++ +++ ++++ 23 BT4 + + + ++ +++ ++++ 24 BT7 _ + + + ++ +++ ++++ 25 BT9 - + + + ++ ++ +++ 26 BT10 - + + + ++ ++ ++ 27 BT12 - - + + + ++ ++++ ++++ +++ ++++ _ +++ ++++ Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE 85%; ++ : CPE 50%; +: CPE 20%; +: nghi ngờ có bệnh tích tế bào; -: khơng có CPE ... - Phân lập virus từ cá mú tự nhiên có biểu bệnh hoại tử thần kinh - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học cá mú. .. cấp nhà nước, mã số: KC04.03/11-15 ,Khoa công nghệ sinh học Viện Đại học mở Hà Nội thực đề tài: ? ?Phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú (Epinephelus spp.)”... thường gây bệnh cá mú virus Nodavirus gây bệnh Viral Nervous Necrosis (VNN) bệnh Virus Iridovirus Virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú (Viral nervous - VNN) nguyên nhân gây chết cá mú công