phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour ) pers )

Các loài xạ khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật và tạo ra một số hợp chất thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ.. Việc phân lập xạ khuẩn nội sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

PHẠM NGỌC LÂM

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN

CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

PHẠM NGỌC LÂM

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY

MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHÍ QUYẾT TIẾN PGS.TS VŨ THU TRANG

Hà Nội - Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Học viên: Phạm Ngọc Lâm

Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn : TS Phí Quyết Tiến

Học viên

Phạm Ngọc Lâm

LỜI CẢM ƠN

Đối với mỗi học viên cao học, luận văn tốt nghiệp là một công trình khoa học nhỏ nhưng mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành đầu tiên của mỗi người trên con đường ứng dụng những kiến thức đã được học vào thực tiễn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến, Phó

Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam và PSG.TS Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu để giúp tôi hoàn thành luận văn này

Trong thời gian thực tập và làm việc tại phòng Công nghệ Lên men - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ,

sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn, kĩ thuật và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ phòng Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập để đạt được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 10 năm 2017

Học viên

Phạm Ngọc Lâm

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 DNA Deoxyribonucleic acid

2 FISH Fluorescent insitu hybridization

3 IAA Indole acetic acid

11 PKS-I Polyketide synthase type I

12 PKS-II Polyketide synthase type II

13 RNA Ribonucleic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hoạt chất được tìm thấy ở xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 10Bảng 1.2 Một số loài xạ khuẩn nội sinh hiếm được phân lập từ cây dược liệu 16Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 32Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ các mẫu cây Màng tang tại Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ 35Bảng 3.2 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của một số chủng xạ khuẩn 45Bảng 3.3 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28 51Bảng 3.4 Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi trường 52Bảng 3.5 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C 53Bảng 3.6 Nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của chủng MPT28 54Bảng 3.7 Độ tương đồng của trình tự gen 16S rRNA của xạ khuẩn MPT28 với trình

tự gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 56

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Bản đồ vị trí 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao và việc lấy mẫu để phân lập xạ khuẩn nội sinh 15Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh lần lượt trên môi trường ISP5 (a), SPA (b), HV (c), TA (d), STA (e), CA (f) sau 6 tuần nuôi cấy 34Hình 3.2 Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây Màng tang: số liệu tổng số của 03 vùng (a); số liệu thống kê theo từng vùng (b) 38Hình 3.3 Sự phân bố của xạ khuẩn nội sinh trên các loại môi trường phân lập khác nhau 39Hình 3.4 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh phân bố theo nhóm màu sắc khuẩn ty ở Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ 41Hình 3.5 Biểu đồ thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 143 chủng xạ khuẩn nội sinh 42Hình 3.6 Khả năng kháng vi sinh (VSV) vật kiểm định của 47 chủng xạ khuẩn nội sinh (XKNS) 43

Hình 3.7 Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus

cereus ATCC 11778 (B) của một số chủng xạ khuẩn nội sinh 44

Hình 3.8 Tỉ lệ chủng xạ khuẩn kháng ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định phân

bố ở Thanh Hoá, Hà Nội và Phú Thọ 47Hình 3.9 Tỉ lệ chủng kháng ít nhất một vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ, thân, lá 49Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc (a) trên môi trường ISP1 và bề mặt chuỗi bào tử (b) dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng MPT28 52Hình 3.11 Điện di đồ DNA tổng số (a) và sản phẩm PCR (b) trên gel agarose 1,0% 55Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại của chủng MPT28 57

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 2

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 3

1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh 3

1.1.2 Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật 4

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 4

1.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 11

1.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 11

1.2.2 Môi trường phân lập 13

1.2.3 Các nghiên cứu cải tiến hiệu quả phân lập 13

1.3 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 14

1.3.1 Đa dạng thực vật - nguồn tiềm năng về sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh 14 1.3.2 Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo phương pháp phân lập và chủng loại 18

1.4 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 21

1.4.1 Kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 22

1.4.2 Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp chất trao đổi thứ cấp 23

1.5 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ở Việt Nam 24

1.6 Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh 25

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật 28

2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 28

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu 29

2.2.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Màng tang 29

2.2.3 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ……… 30

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 30

2.2.5 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rRNA ……… 32

2.1.1 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân lập và đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại các vùng sinh thái khác nhau 34

3.1.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ 34

3.1.2 Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang 37

3.2 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh ……….42

3.2.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân bố theo các vùng sinh thái khác nhau 47

3.2.2 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân bố theo vị trí trên cây 49

3.3 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MTP28 50

3.3.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 51

3.3.2 Phân loại dựa trên xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn MPT28 ……… 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 71

MỞ ĐẦU

Sự xuất hiện của những vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh cùng với sự lây lan rộng lớn của chúng đang là mối đe dọa nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm hàng đầu của cộng đồng Sự gia tăng của những tác nhân gây bệnh này đã cho thấy nhiều loại thuốc kháng sinh hiện nay đã lỗi thời và không còn hiệu quả Trong khi đó, những thành công của các giải pháp thay thế như tổng hợp hóa học vẫn còn rất hạn chế, đã tạo ra một khoảng trống trên con đường tìm ra các loại thuốc mới Vì vậy, cho đến nay, các nhà khoa học và các doanh nghiệp dược phẩm trên thế giới vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại kháng sinh mới nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc như hiện nay

Xạ khuẩn là đối tượng quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới về độ đa dạng và các hoạt chất sinh học của chúng, đặc biệt là các chất

kháng sinh Các loài xạ khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật và tạo ra một số hợp

chất thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ Trong số các hợp chất này, các chất có hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học Việc phân lập xạ khuẩn nội sinh và sàng lọc các chủng xạ khuẩn

có khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng khuẩn là một hướng nghiên cứu tiềm năng

Cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) là một loại dược liệu phân bố ở

các nước châu Á, trong đó có Việt Nam Chúng chứa nhiều tinh dầu mà thành phần chính là citral, có tác dụng kháng khuẩn, kháng ung thư, và chống oxy hóa Mặc dù tinh dầu Màng tang được sử dụng nhiều trong cuộc sống nhưng đến nay số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang và khả năng kháng khuẩn của chúng tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Xuất phát từ những định hướng trên,

chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học

của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)”

Mục tiêu của đề tài: Phân lập, đánh giá và lựa chọn các chủng xạ khuẩn nội

sinh trên cây Màng tang có khả năng kháng khuẩn cao

Đề tài được thực hiện tại ph ng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung ch nh:

- Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây Màng tang thu thập tại 03 vùng: Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ

- Sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu

1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh

Ngày nay, rất nhiều loại vi sinh vật phổ biến như vi khuẩn và nấm, xạ khuẩn

đã được tìm thấy ở các mô bên trong cây Các vi sinh vật này sống bên trong các

mô thực vật mà không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây chủ Hầu hết thực vật đều có một hoặc nhiều loài vi sinh vật sống trong mô của chúng Các vi sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa thúc đẩy tăng trưởng, thuốc chống côn trùng và sâu bệnh, kháng sinh chống lại mầm bệnh thực vật, bảo vệ cây chủ trong điều kiện stress môi trường Chúng cũng có tiềm năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có thể khai thác ứng dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và các ngành khác [71]

Thuật ngữ ―nội sinh‖ (endophyte) được đưa ra đầu tiên bởi De Bary năm

1866 Từ đó, nhiều định nghĩa khác nhau được đưa ra bởi các nhà nghiên cứu khác nhau với một vài thay đổi Tổng hợp các định nghĩa và các nhà khoa học đã thống nhất là ―Sinh vật nội sinh là tập hợp những vi sinh vật sống trong các mô của thực vật bậc cao cũng như các thực vật nhỏ mà không gây bất kỳ ảnh hưởng xấu nào cho cây chủ‖ Chúng đã được chứng minh là nguồn sản xuất các sản phẩm tự nhiên

phong phú có nguồn hoạt tính sinh học [82]

Trong số các vi sinh vật nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi khả năng tổng hợp kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò quan trọng của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh Xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật rất đa dạng và phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt t nh như: các chất kiểm soát sinh học, chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất

k ch th ch sinh trưởng [76] Vì vậy, các nhà khoa học ngày càng quan tâm nghiên cứu khảo sát đa dạng sinh học của các xạ khuẩn sống trong thực vật ở các hệ sinh thái khác nhau nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt

tính kháng sinh nói riêng

1.1.2 Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật

Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, việc tìm hiểu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Okazaki và cộng sự

(2003) đã quan sát thấy quá trình xâm nhiễm của Microbispora sp., vào bên trong các tế bào biểu bì và Streptomyces galbus vào mầm cây đỗ quyên (Rhododendron) bằng kính hiển vi điện tử quét [68] Năm 2006, Watt và cộng sự đã nghiên cứu sự

có mặt của xạ khuẩn trong các mô thực vật bằng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), sử dụng đầu d đặc hiệu cho xạ khuẩn [103] Nhiều nghiên cứu cho rằng, các mô thực vật có những hốc thích hợp cho sự xâm nhập và sinh sống của các vi sinh vật, tạo nên các mối quan hệ có tính cộng sinh, ký sinh hoặc gây bệnh

Xạ khuẩn nội sinh là các quần thể vi sinh vật có nguồn gốc từ đất vùng rễ của thực vật Các vi sinh vật thường xâm nhập vào trong mô thực vật qua các khe hở của lỗ khí, vết thương, lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ non, biểu bì và theo các kênh dẫn truyền nước, dinh dưỡng để đi vào các mô bên trong Hầu hết xạ khuẩn hình thành

hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên, các vết thương do cơ học hoặc côn trùng Xạ khuẩn nội sinh tổng hợp ra một số hợp chất để thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ Các hợp chất chuyển hóa này đang được nghiên cứu như một nguồn tiềm năng cung cấp các hợp chất có ứng dụng trong điều trị, kiểm soát sinh học và một số ứng dụng khác [75]

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

1.1.3.1 Ứng dụng trong công nghệ sinh học và y dược

Năm 2006, El-Shatoury và cộng sự tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống sốt

rét của Streptomyces sp phân lập từ Artemisia herba-alba, Echinops spinosus,

Balotta undulate và Mentha longifolia Các tác giả đã thử nghiệm tác động gây độc

tế bào ấu trùng Artemia salina của 27 trong số 41 xạ khuẩn nội sinh Kết quả cho

thấy, 9 chủng có khả năng ức chết và giết chết ấu trùng với tỉ lệ lên tới 100% sau 12

giờ, các chủng này chủ yếu thu nhận từ cây Artemisia herba-alba và Echinops

spinosus [21] Tương tự, Tanvir và cộng sự (2014) cũng cho thấy Streptomyces albovinaceus và S badius được phân lập từ các loài thực vật trong họ Cúc

(Asteraceae) cũng có tiềm năng đáng kể về khả năng tiêu diệt ấu trùng muỗi (Culex

quinquefasciatus) ở giai đoạn đầu và giai đoạn 4 trong chu trình phát triển của

chúng [96] Castillo và cộng sự (2002) đã phát hiện hợp chất munumbicins D có

hoạt tính kháng lại ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), với giá trị IC50

(inhibitory concentration 50%) là 4,5 ng/ml Các tác giả cũng mô tả hoạt động nổi

bật của mỗi loại munumbicins A, B, C, D kháng lại P falciparum nằm trong phạm

vi có ý nghĩa dược lý với gía trị IC50 lần lượt là 175; 130; 6,5 và 4,5 ng/ml Munumbicins C và D gây sự chú ý đặc biệt với các tác giả do giá trị IC50 cực kỳ thấp Hơn nữa, họ cũng báo cáo rằng munumbicins B, C và D không gây bất kỳ sự

ly giải hồng cầu nào ở người với nồng độ 80 µg/ml Do đó, để sử dụng các hợp chất này làm thuốc chống sốt rét hoặc chống nhiễm trùng cần thêm kết quả từ những nghiên cứu kiểm tra độc tính trên tế bào và lâm sàng [11]

Ngoài các ứng dụng về kháng sốt rét kể trên, xạ khuẩn nội sinh c n được biết đến với việc tổng hợp các hợp chất có hoạt tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư Gần đây, một hợp chất mới có tên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phát hiện lần đầu tiên từ

Streptomyces sp CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây

thuốc có tác dụng điều trị ung thư, hoạt huyết, Kết quả nghiên cứu cho thấy naphthomycin K có khả năng gây độc và ức chế dòng tế bào P388 (tế bào ung thư bạch cầu) và A-549 (tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt của người) ở nồng độ lần lượt là 0,07 và 3,17 µM [58] Hai hợp 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7-dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh,

được tìm thấy trong loài Streptomyces aureofaciens CMUAc130 nội sinh Hoạt tính

kháng ung thư của hai chất này không chỉ ở việc hình thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà c n cảm ứng nitric oxide synthase và cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào

RAW 264.7 Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành TNF-α [92]

Ngoài việc đóng vai tr quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đã được khoa học biết đến từ lâu Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của chúng có ý nghĩa rất quan trọng đối với sức khỏe con người Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất phá hủy tế bào hồng cầu

của động vật (như haemolysin ở Rhodococcus equi) Các nhà khoa học đã phát hiện

các hợp chất này từ xạ khuẩn có tiềm năng rất lớn trong việc làm tan cụcmáu đông

ở người bị bệnh tim mạch Trong phòng thí nghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu từ xạ khuẩn được tiến hành trên mẫu máu động vật như máu ngựa, máu thỏ [78] Một ví dụ khác là việc tạo ra các hợp chất có hoạt tính chống các tác nhân gây oxy hóa, nhờ đó làm tăng tuổi thọ của tế bào Nguyên lý hoạt động của các chất chống oxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tương tự như axit ascorbic (vitamin C) hay tocopherol (vitamin E) Các hợp chất này trung hòa thể oxy hóa rất cao của các hợp chất oxy hóa (được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào hay dưới tác dụng của tia cực tím) qua đó làm giảm tác dụng oxy hóa của chúng [89] Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh trên 13

cây dược liệu chữa bệnh tiểu đường như cây lô hội (Alloe vera), dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica) Trong đó, các chủng thể hiện

hoạt tính α-glucosidase ức chế quá trình thủy phân tinh bột thành glucose thẩm thấu vào ruột non Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn được chủng BWA65 có hoạt tính ức chế α- glucosidase gấp hơn hai lần so với chất có hoạt t nh tương tự thu được từ dịch chiết cây dây ký ninh [88]

Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với sự sinh trưởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên c n chưa rõ ràng, nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực công nghệ sinh học và y dược đã được chứng minh Chính vì lý do này, các nhà khoa học hiện nay rất quan tâm tới

việc nghiên cứu phân lập xạ khuẩn nội sinh và sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ chúng

1.1.3.2 Ứng dụng trong nông nghiệp

Xạ khuẩn nội sinh có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất nông nghiệp Chúng là nhân tố thúc đẩy quá trình chuyển hóa, cải thiện sự tăng trưởng cây chủ cũng như giảm các triệu chứng bệnh do các tác nhân vi sinh vật hay stress môi trường gây ra [71] Các nhà khoa học cũng chứng minh khả năng k ch th ch sinh trưởng thực vật

và sinh tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn nội sinh Năm 2013,

Dochhil và cộng sự đã sử dụng hai chủng Streptomyces sp phân lập từ cây rau má (Centella asiatica) để kích thích sự sinh trưởng của cây trồng và nẩy mầm của hạt

Kết quả cho thấy, cây trồng sinh trưởng tốt hơn và khả năng nảy nầm của hạt được nâng cao Các chủng này có khả năng tổng hợp axit indole acetic (IAA) – một chất

k ch th ch sinh trưởng thực vật – với nồng độ đạt 71 µg/ml và 197 µg/ml [19]

Shutsrirung và cộng sự (2014) chứng minh các chủng thuộc chi Nocardiopsis có

khả năng sản xuất IAA cao nhất trong số tất cả các chi khác [86] Trong các thử nghiệm thực địa được thực hiện bởi El-Tarabily cộng sự (2010), các chủng

Actinoplanes campanulatus, Micromonospora chalcea và Streptomyces spiralis

được sử dụng riêng lẻ và kết hợp với nhau Kết quả là các chủng này làm kích thích tăng trưởng và tăng năng suất cây dưa leo [24]

Igarashi (2004) và Igarashi và cộng sự (2002) đã thu nhận axit pteridic A và

B có hoạt tính giống auxin từ Streptomyces hygroscopicus phân lập trên cây dương

xỉ (Pteridium aquilinum) làm chất k ch th ch tăng trưởng thực vật Axit pteridic gây

ra sự hình thành rễ bất định của cây đậu thận (Phaseolus vulgaris), ở nồng độ 1 mM

hiệu quả như IAA Ngoài ra, các tác giả nhận định rằng axit pteridic A kích thích sự kéo dài rễ ở nồng độ 20 ppm Tuy nhiên, sự nảy mầm của lúa đã bị ức chế khi xử lý với IAA nồng độ 100 ppm [41, 42] Nghiên cứu của Gangwar và cộng sự (2014)

cũng cho thấy xạ khuẩn nội sinh mà chủ yếu là Streptomyces sp có khả năng sản

xuất IAA với hàm lượng khoảng 9,0-38,8 µg/ml [29]

Bên cạnh khả năng sinh tổng hợp các chất k ch th ch sinh trưởng, xạ khuẩn nội sinh còn tổng hợp nhiều hợp chất giúp cây trồng chống lại các mầm bệnh Xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà vi sinh vật, bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do khả năng tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng vi sinh vật gây bệnh Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xạ

khuẩn nội sinh chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Rhizoctonia solani,

Verticillium dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var tritici, Fusarium oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum orbiculare [15, 26] Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm

trao đổi chất như chất kháng khuẩn, kháng nấm, enzyme thủy phân, phytohormone Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch

đối với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào Ví dụ như chủng S galbus R-5

không chỉ sinh cellulase, pectinase mà còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp tăng cường sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cường sản sinh jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [84] Conn và cộng sự (2008) công bố

kết quả nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp EN27 và Micromonospora sp EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F oxysporum, kích hoạt biểu hiện gen tổng

hợp axit jasmonic, axit salicilic và etylen [14]

Xạ khuẩn nội sinh có thể tổng hợp các hợp chất kháng nấm như siderophores

và chitinase Chitin là polysaccharide đặc trưng nhất của thành tế bào nấm Các xạ khuẩn nội sinh có thể phân huỷ tế bào nấm do khả năng sản xuất chitinase [25] Vai trò của các phân tử siderophores sinh ra bởi các xạ khuẩn nội sinh đã được quan tâm nhiều hơn bởi những chất này tham gia vào việc kích thích sự phát triển của cây chủ cũng như sự đối kháng với tác nhân gây bệnh ở thực vật El-Shatoury và cộng sự

(2009) đã công bố xạ khuẩn nội sinh thu nhận được từ cây Achillea fragrantissima

có khả năng sản xuất chitinase hoặc siderophores đồng thời cũng cho thấy hoạt động ức chế đáng kể đối với nấm gây bệnh trên cây trồng Enzyme chitinase được

sinh ra bởi loài Actinoplanes missouriensis gây phân giải sợi nấm và giảm sự nảy

mầm của bào tử đ nh [22, 25] Kết quả của El-Shatoury cộng sự (2009) đã được Gangwar và cộng sự (2014) củng cố, các tác giả ghi nhận sản phẩm siderophores dạng hydroxamate dao động từ 5,9-64,9 µg/ml và dạng catechol trong khoảng 11,2-

23,1 µg/ml trong môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Aloe vera,

Mentha arvensis và Ocimum sanctum [29] Trong một nghiên cứu khác, El-Tarabily

và cộng sự (2010) đã sử dụng Actinoplanes campanulatus, Micromonospora

chalcea và Streptomyces spiralis để điều trị thành công bệnh thối cổ rễ ở cây dưa

leo trưởng thành do tác nhân là nấm Pythium aphanidermatum Các tác giả cũng

cho rằng những dòng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm có thể sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học [24]

Năm 2004, Igarashi tìm thấy hợp chất 6-prenylindole từ Streptomyces sp được phân lập từ cây hành lá (Allium fistulosum) có hoạt tính kháng lại các tác nhân gây bệnh trên thực vật như nấm Alternaria brassicicola và F oxysporum Hợp chất

6-prenylindole lần đầu tiên được tìm thấy là một thành phần trong cây rêu tản (lớp Hepaticae) Đây là một ví dụ thú vị về sự phát hiện của cùng một hợp chất từ thực vật và vi sinh vật Tác giả cũng báo cáo hợp chất fistupyrone thu nhận từ

Streptomyces sp có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm A brassicicola,

tác nhân gây ra bệnh đốm đen – một bệnh phổ biến của cây trồng họ cải (Brassicaceae) Mặc dù fistupyrone không thể hiện hoạt tính kháng A brassicicola

ở điều kiện in vitro, nó ức chế hoàn toàn sự xâm nhiễm của A brassicicola khi xử

lý các cây con với nồng độ 100 ppm của hợp chất này [41] Các nghiên cứu của Igarashi và cộng sự (2002) cho thấy fistupyrone không ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm nhưng có khả năng ngăn chặn nảy mầm của bào tử nấm ở nồng độ 0,1 ppm [42] Năm 2014, Zhang và cộng sự tìm thấy bốn hợp chất mới có dẫn xuất indole là 3-acetonylidene-7-prenylindolin-2-one, axit 7-isoprenylindole-3-carboxylic, 3-cyanomethyl-6-prenylindole và axit 6-isoprenylindole-3-carboxylic từ

chủng Streptomyces sp neau-D50, có hoạt tính kháng các loại nấm gây bệnh trên thực vật như Colletotrichum orbiculare, Phytophthora capsici, Corynespora

cassiicola và F oxysporum với các giá trị IC50 trong khoảng 30,55-89,62 µg/ml

lá

Kibdelosporangium sp., Kitasatosporia sp., Nocardia sp., Nocardioides sp., Promicromonospora sp., Pseudonocardia sp., Streptomyces sp

Siderophores, Chitinase

lá

Actinopolyspora sp., Micromonospora sp., Saccharopolyspora sp., Streptomyces sp

Siderophore (hydroxamate và catechol), Indole acetic acid (IAA)

Riềng nếp (Alpinia

galanga)

Rễ Microbispora sp., Micromonospora sp., Nocardia sp.,

lá

Streptomyces setonii, Streptomyces sampsonii, Streptomyces sp Q21, Streptomyces sp MaB-

hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi xạ khuẩn giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng

1.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh

1.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh

Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập xạ khuẩn nội sinh Takahashi và Omura (2003) nhấn mạnh rằng sự đa dạng của xạ khuẩn phụ thuộc chủ yếu vào các phương pháp phân lập Qua đó, quá trình xử lý mẫu bằng khử trùng bề mặt là một bước quan trọng được sử dụng nhiều nhất trong các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh [95] Ngoài ra, kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh trên thực vật còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm: loài cây chủ, tuổi của cây chủ và loại mô, phân bố địa lý và môi trường sống, mùa lấy mẫu, hóa chất khử trùng bề mặt, môi trường phân lập và điều kiện nuôi cấy [28]

Nhìn chung, quy trình phân lập xạ khuẩn nội sinh bắt đầu từ việc thu gom các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa, quả, được xử lý tươi hoặc bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi tiến hành phân lập (trong vòng 24 giờ) Các mẫu được rửa sạch bằng nước máy để loại bỏ đất, bụi bẩn, và các mô chết, sau đó được khử trùng

bề mặt bằng cách sử dụng một hoặc nhiều chất khử trùng khác nhau Hóa chất được

sử dụng để khử trùng bề mặt phổ biến nhất bao gồm ethanol và một chất oxy hóa mạnh hoặc chất khử trùng thông thường như NaOCl 2-5% (w/v) và chlorine trong 2-4 phút [71] Dochhil (2013) sử dụng kết hợp sodium chlorate (NaClO3) 5%, sodium thiosulfate (Na2S2O3) 2,5%, ethanol 75% và natri bicarbonate (NaHCO3) 10% làm các chất khử trùng mẫu để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, có tác dụng làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [19] Trong quá trình khử trùng bề mặt, nếu loại mẫu thực vật dễ bị hóa chất xâm nhập vào trong thì các mô bên trong sẽ bị khử trùng, do đó ảnh hưởng lớn đến kết quả phân lập [36] Các mẫu sau khi xử lý hóa chất được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ (1 cm đối với thân hoặc rễ và 1 cm2 đối với lá) hoặc nghiền vụn và cấy vào các môi trường thích hợp Trong một số nghiên cứu, các mô thực vật sau khi khử trùng bề mặt được ngâm và đồng nhất hoàn toàn trong đệm phosphate hoặc môi trường thích hợp Sau

đó, các dung dịch này được pha loãng theo thứ tự từ 10-1

đến 10-5 và cấy trải trên môi trường thạch thích hợp để thu nhận các xạ khuẩn nội sinh Trong quá trình phân lập, một vấn đề mà các nhà nghiên cứu thường gặp phải trong hai tuần đầu tiên nuôi cấy là vi khuẩn và nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật thường phát triển mạnh hơn xạ khuẩn Để khắc phục vấn đề này, môi trường phân lập thường được được bổ sung các kháng sinh như axit nalidixic, nystatin và cycloheximide (50 hoặc 100 µg/ml) để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm nội sinh Sau khi nuôi ở nhiệt

độ 26 ± 2°C trong 15-30 ngày, các khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn mọc trên các đĩa môi trường Các khuẩn lạc này được chọn lọc và tiến hành cấy trên môi trường thích hợp để tinh sạch Hiệu quả của phương pháp khử trùng bề mặt được kiểm tra bằng cách cấy nước rửa mẫu cuối cùng vào một đĩa môi trường phân lập và nuôi cấy cùng điều kiện với các đĩa môi trường chứa mẫu khác [71]

1.2.2 Môi trường phân lập

Thành phần môi trường là một yếu tố quan trọng quyết định đến kết quả phân lập và phát hiện các loài xạ khuẩn mới [68] Có nhiều loại môi trường dùng để phân lập xạ khuẩn nội sinh đã được mô tả bởi các tác giả như: starch casein, glycine–glycerol [51], starch casein nitrit (SCNA), chitin-vitamin B, humic acid vitamin B agar (HV) [39], tap water-yeast extract (TWYE) [17], yeast extract casamino acid (YECA), synthetic, Gausse cải biên [64] Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng môi trường bao gồm axit humic và vitamin để phân lập xạ khuẩn hiếm gặp thường cho hiệu quả cao [47] Bên cạnh đó, một số môi trường được bổ sung axit amin (arginine, asparagine, và proline) làm nguồn nitơ và cellulose, natri propionat, natri succinat và xylan như các nguồn cacbon, cũng cho hiệu quả phân lập cao đối với một số loại xạ khuẩn hiếm gặp [75] Zhao và cộng sự (2011) đã nhấn mạnh sự cần thiết về việc sử dụng các phương pháp và môi trường phân lập mới để phát hiện và nghiên cứu về sự đa dạng của các loài xạ khuẩn nội sinh trong cây dược liệu [109]

1.2.3 Các nghiên cứu cải tiến hiệu quả phân lập

Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về việc cải biến môi trường cũng như phương pháp phân lập để tăng hiệu quả phát hiện các loài xạ khuẩn được công bố Năm 2014, Machavariani và cộng sự đã cải biến phương pháp xử lý mẫu bằng cách

sử dụng dung dịch các chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thực vật là heceroauxin

và zircon, giúp phát hiện và tăng số lượng các xạ khuẩn hiếm được thu nhận từ các cây dược liệu [60] Năm 2012, Li và cộng sự đã sử dụng nhiều phương pháp khác

nhau để phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua

L.) và nhận thấy sự đa dạng của xạ khuẩn phân lập được ở mỗi phương pháp có sự khác nhau rõ rệt về chủng loại Cụ thể là, phương pháp 1: mẫu được nghiền nhỏ rồi cấy lên 6 môi trường khác nhau, kết quả thu được một lượng lớn các xạ khuẩn thuộc

chi Amycolatopsis, Blastococcus và Glycomyces; phương pháp 2: mẫu được nghiền

nhỏ rồi đồng nhất trong nước cất vô trùng, sau đó lọc lấy dịch và cấy lên 6 môi

trường khác nhau, thu được một lượng lớn xạ khuẩn thuộc chi Promicromonospora,

Pseudonocardia, Rhodococcus; phương pháp 3: mẫu được nghiền nhỏ sau đó sấy ở

85°C để chọn lọc các chủng chịu nhiệt, thu được các xạ khuẩn thuộc chi

Streptosporangium, Actinomadura, Microbispora, Nonomuraea và

Phytomonospora [55] Một số phương pháp mới như sử dụng enzyme để xử lý mẫu

và ly tâm để làm giàu tế bào xạ khuẩn cũng đã được nghiên cứu Các phương pháp này có thể phát hiện được hầu hết các xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật và đặc biệt hữu ích cho việc phân lập xạ khuẩn hiếm gặp [44] Tuy vậy, trong tương lai, một số phương pháp xử lý mẫu tiên tiến cần được thiết kế và nghiên cứu để tăng hiệu quả phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu [71]

1.3 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

1.3.1 Đa dạng thực vật - nguồn tiềm năng về sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh

Các nhà sinh vật học bảo tồn đã nghiên cứu, dữ liệu hóa và phân loại các loài thực vật đặc hữu trong những vùng sinh thái có độ tập trung đặc biệt cao Đây là những hệ sinh thái trên cạn có t nh đa dạng sinh học cao nhất, chứa 1500 loại thực vật (0,5% trên tổng số 300 000 loài trên thế giới) Những vùng này trở thành tâm điểm của sự đa dạng thực vật được biết đến là những nơi có phân bố các loài đặc hữu Hiện tại, Tổ chức Bảo tồn Quốc tế xác định có 34 vùng đa dạng thực vật cao (Hình 1.1) [66]

Trong số 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao, chỉ một số t được lựa chọn để lấy mẫu cho việc phân lập xạ khuẩn nội sinh và đánh các chất có hoạt tính sinh học, mặc dù việc nghiên cứu nấm nội sinh đã được tiến hành sớm hơn [90] Cơ sở của việc chọn loài thực vật để nghiên cứu xạ khuẩn chủ yếu dựa vào các cây dược liệu truyền thống, đặc hữu của bản địa và điều kiện sinh thái của vùng Vùng nhiệt đới Andes là một nơi có độ đa dạng thực vật cao hàng đầu, ở đây chứa tới 6,7% loài

thực vật đặc hữu trong số 44% trên toàn cầu [65] Loài Streptomyces MSU-2110

duy nhất tổng hợp kháng sinh peptide coronamycin đã được phân lập từ cây

Monstera sp thuộc khu vực này [26] Năm 2009, Bascom-Slack và cộng sự phân

lập được 14 chủng với tiềm năng sinh tổng hợp kháng sinh cao từ 300 mẫu thực vật thu thập tại khu vực Lake Titicaca của vùng này [9] Một số địa điểm như rừng nhiệt đới Xishuangbanna thuộc tỉnh Vân Nam, cao nguyên Panxi tỉnh Tứ Xuyên phía Tây Nam Trung Quốc và các khu bảo tồn thiên nhiên của tỉnh Phúc Kiến phía Đông Nam Trung Quốc là những khu vực tiềm năng của các cây dược liệu quan trọng vì ở đó có điều kiện địa lý độc đáo và lượng mưa dồi dào Nhiều nghiên cứu

về xạ khuẩn nội sinh từ cây dược liệu truyền thống trong y học cổ truyền Trung Quốc được thu thập từ các vùng này và các xạ khuẩn hiếm thu nhận được đã công

bố [55, 75, 77, 109] Một số lượng nhỏ cây dược liệu của bán đảo Malayan và hai vùng có độ đa dạng sinh học cao ở Ấn Độ là khu vực Himalaya và Western Ghats – những khu vực có nhiều loài đặc hữu - đã được lấy mẫu để phân lập xạ khuẩn nội sinh [6, 70, 110]

Hình 1.1 Bản đồ vị trí 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao và việc lấy mẫu để phân

lập xạ khuẩn nội sinh

Các khu vực rừng mưa nhiệt đới đại diện cho những vùng giàu có và đa dạng sinh học trên trái đất Rừng mưa nhiệt đới Xishuangbanna ở Tây Nam- Trung Quốc

là đại diện thích hợp, khu vực này chứa 16% đa dạng thực vật của Trung Quốc với

3000 loài đặc hữu Xạ khuẩn nội sinh với tiềm năng khai thác các chất có hoát tính

sinh học cao đã được phân lập từ khu vực này [66] Năm 2009, Qin và cộng sự đã lấy mẫu 90 loài dược liệu để tiến hành nghiên cứu và cho thấy sự đa dạng của xạ

khuẩn nội sinh ở vùng này Ngoài các loài thuộc chi Streptomycetes,

Nonstreptomycetes, Pseudonocardia, Nocardiopsis và Micromonospora đã được

báo cáo, còn phát hiện các loài thuộc chi hiếm như Lentzea, Tsukamurella,

Gordonia, Dietzia, Kineosporia, Janibacter, Kineococcus, Dactylosporangium, Nonomuraea, Herbidospora và Glycomyces spp Sự đa dạng của xạ khuẩn đã được

đánh giá có liên quan đến điều kiện địa lý trong rừng mưa nhiệt đới tại thời điểm lấy mẫu [75] Nhiều loài dược liệu lần đầu tiên được nghiên cứu và báo cáo về sự phân lập Do đó, các loài thực vật ở rừng nhiệt đới được cho là một nguồn tiềm năng của các loài xạ khuẩn hiếm và nhiều loài mới (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số loài xạ khuẩn nội sinh hiếm được phân lập từ cây dược liệu [66]

Trung Quốc Cơm cháy (Sambucus adnata)

Glycomyces sambucus sp nov Thân

Cercidiphyllum japonicum

Rhodococcus cercidiphylli sp nov Lá

Dietzia cercidiphylli sp nov Rễ

Gió bầu (Maytenus

austroyunnanensis)

Saccharopolyspora endophytica sp

nov

Glycomyces mayteni sp nov

Streptomyces mayteni sp nov

Rễ

Plantactinospora mayteni gen nov., sp

nov

Nonomuraea antimicrobica sp nov

Actinomadura flavalba sp nov

Lá

Jiangella alba sp nov

Pseudonocardia tropica sp nov

Thân

Lôi công thằng

(Trypterygium wilfordii)

Kineosporia mesophila sp nov Thân

Trypterygium Saccharopolyspora tripterygii sp nov Thân

hypoglaucum

Thúy điệp (Lobelia

clavata)

Pseudonocardia endophytica sp nov Rễ

Polyspora axillaris Micrococcus yunnanensis sp nov Rễ

Ngót nghẻo (Gloriosa

superba L.)

Saccharopolyspora gloriosae sp nov Thân

Thanh hao hoa vàng

(Artemissia annua L.)

Nonomuraea endophytica sp nov Thân

Pseudonocardia artemisiae sp nov

Streptomyces artemisiae sp nov

Streptomyces endophyticus sp nov

Rễ

Pseudonocardia serianimatus sp nov Lá Tây Nam,

Trung Quốc Nghệ vàng (Curcuma phaeocaulis)

Streptomyces phytohabitans sp nov Rễ

Hà Bắc -

Trung Quốc

Ngải diệp (Artemissia

argyi)

Glycomyces artemisiae sp nov Rễ

Cho đến nay, chỉ có 11,8% trong số 34 vùng đa dạng thực vật cao đã được lấy mẫu đại diện để phân lập xạ khuẩn nội sinh Có nhiều lý do khác nhau làm tỷ lệ các vùng có đa dạng thực vật cao được nghiên cứu thấp như: địa hình không thể tiếp cận tại các địa điểm lấy mẫu, thiếu nhân lực được đào tạo và thiếu tài liệu về phân loại thực vật ở một số khu vực [66] Khu vực phía Bắc của châu Úc là nơi trú ngụ

của thổ dân Manyallaluk, những người dân ở đây sử dụng những cây Kennedia

nigriscans để điều trị vết thương và nhiễm trùng Dựa vào đặc điểm đó, Castillo và

cộng sự (2002) đã lấy mẫu loài cây này và phân lập được chủng Streptomyces sp có

khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng mới thuộc nhóm peptide là munumbicins Kháng sinh này được đặt theo tên của Reggie Munumbi Miller thuộc cộng đồng người Manyallaluk [11] Năm 2003, Castillo và cộng sự đã phân lập

được loài Streptomyces sp từ cây Grevillea pteridifolia thuộc khu vực này có khả

năng sản xuất kháng sinh kakadumycin [12] Vùng nhiệt đới bao gồm Papua New Guinea, quần đảo Solomon và Mborokua nằm kề bên Archipelago là những vùng hoang dã nhiệt đới có mức độ đa dạng sinh học cao Janso và Carter (2010) đã phân lập được 123 chủng xạ khuẩn nội sinh thuộc 22 chi, trong đó có các chi hiếm như

Sphaerisporangium và Planotetraspora từ các cây nhiệt đới của vùng này [45] Do

chưa có đủ dữ liệu về hệ thực vật trong một số vùng đa dạng sinh học, vì thế, một tiềm năng rộng lớn cho việc phân lập các xạ khuẩn nội sinh mới chưa được nghiên cứu

1.3.2 Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo phương pháp phân lập và

thuộc chi Streptomyces, Microbispora và các loài không phổ biến hoặc hiếm gặp

thường được thu nhận bằng các kỹ thuật phân lập khác nhau [66] Cho đến nay, xạ khuẩn nội sinh đã được phân lập từ nhiều loài cây trồng như lúa mì, gạo, khoai tây,

cà rốt, cà chua, nho và nhiều cây dược liệu như xuyên tâm liên, nghệ xanh, dây kí ninh, thanh hao hoa vàng, Cũng như xạ khuẩn phân lập từ đất, tỷ lệ xạ khuẩn nội

sinh thuộc chi Streptomyces chiếm hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora,

Micromonospora, Nocardioide, Nocardia và Streptosporangium [76]

Theo một số nhóm nghiên cứu, sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bao gồm việc thu thập và lấy mẫu các loại thực vật (thảo dược, cây bụi, cây leo và cây gỗ), phương pháp khử trùng bề mặt và nuôi cấy xạ khuẩn Không giống như các nghiên cứu về t nh đa dạng của nấm - liên quan đến việc phân lập theo mùa hoặc giữa các thời điểm và áp dụng các phần mềm thống kê

để ước tính như là thước đo của chỉ số đa dạng Cho đến nay, không có công bố nào

về việc nghiên cứu xạ khuẩn và phân tích sự đa dạng dựa trên các phần mềm để ước tính Các mô tả, công bố về đa dạng xạ khuẩn nội sinh hoàn toàn dựa trên số chủng

và các nhóm loài khác nhau phân lập được trong các nghiên cứu [66] Theo đó, Taechowisan và cộng sự (2003) thu được 330 xạ khuẩn nội sinh từ 7 loài cây thuốc

vùng Chiang Mai, Thái Lan trong đó số chủng thuộc chi Streptomyces chiếm chủ

yếu (n = 277), theo sau là Microbispora (n = 14), Nocardia (n = 8) và

Microbiospora sp (n = 4) [93] Trong nghiên cứu phân lập xạ khuẩn nội sinh trên

20 mẫu cây Azadirachta indica, Verma và cộng sự (2009) đã thu được 55 chủng với chi Streptomyces chiếm đa số (49,1%), tiếp đến là các chi Streptosporangium (14,5%), Streptoverticillium (5,5%), Microbispora (10,9%), Saccharomonospora (5,5%) và Nocardia (3,6%) [100] Năm 2009, Bascom-Slack tiến hành phân lập xạ

khuẩn nội sinh từ 300 loài thực vật của rừng nhiệt đới Amazon, kết quả thu được 14

loài, trong đó 12 loài thuộc chi Streptomyces, 1 loài thuộc Micromonospora và 1 thuộc Amycolatopsis spp [9] Một nghiên cứu khác trên 26 loài dược liệu ở tỉnh Tứ

Xuyên, Trung Quốc bao gồm các loại thảo mộc và cây bụi được dùng để phân lập

xạ khuẩn nội sinh Kết quả thu được 60 chủng xạ khuẩn, trong đó chi Streptomyces chiếm 50%, và còn lại là các chi Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraea,

Promicromonospora và Rhodococcus [77] Từ 4 loài thảo dược thu thập tại miền

nam Ấn Độ, Akshatha và cộng sự (2016) phân lập được 135 chủng xạ khuẩn nội

sinh Các chủng này thuộc các chi Streptomyces (68%), Arthrobacter (15%),

Patulibacter (3%), Rhodococcus (9%) và Promicromonospora spp (5%) [6] Việc

sàng lọc dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc có nhiều hạn chế, vì thế, một cách tiếp cận đa chiều đã được đề xuất để xác định và phân loại các loài xạ khuẩn bằng cách sử dụng kết hợp các nghiên cứu hình thái, sinh lý và sinh học phân tử Trình tự gen 16S rRNA là một dữ liệu có giá trị trong việc xây dựng cây phát sinh chủng loại của các dòng xạ khuẩn và định danh ở cấp độ loài [66]

Các kết quả nghiên cứu trên đây cho thấy Streptomyces luôn chiếm ưu thế về

mặt số lượng trong tổng số các chủng phân lập được từ thực vật Trong khi đó,

nhóm nghiên cứu của Lee (2008) đã kết luận Microbispora chiếm 67% trên tổng số

81 chủng xạ khuẩn thu được từ rễ cây bắp cải Trung Quốc (Brassica rapa), tiếp theo là Streptomyces spp (12,0%) và Micromonospora spp (11,0%) [53] Janso và

Carter (2010) đã phân lập 123 chủng xạ khuẩn từ 256 mẫu rễ, thân, lá thu được từ

113 loài thực vật vùng Papua New Guinea và Mborokua Island Chúng được phân loại theo trình tự gen 16S rRNA thành 6 họ: Streptomyporaceae và

Streptomycetaceae (40%), Streptomycetaceae (27%), Thermomonosporaceae (16%), Micromonosporaceae (8%), Pseudonocardiaceae (8%) và

Actinosynnemataceae (2%) Trong nghiên cứu này chi Streptomyces trong họ

Streptomycetaceae chỉ chiếm 26%, có nghĩa là xạ khuẩn hiếm (không phải

Streptomyces) chiếm 74% trong tổng số [45] Theo Kizuka và cộng sự (1998), tỷ lệ

phân lập Microbispora từ thực vật cao hơn đất nhiều lần [49] Như vậy, chi

Streptomyces và Microbispora dường như sinh trưởng trên môi trường đất và nội

sinh mặc dù chỉ có một số lượng hạn chế các loài có thể tồn tại theo cả hai phương thức này

Sự phân bố các loài và sự đa dạng sinh học của các xạ khuẩn nội sinh của cây dược liệu bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi môi trường sinh thái El-Shatoury và cộng

sự (2013) cho rằng các loài thực vật có thể được chia thành ba nhóm đại diện cho sự

đa dạng xạ khuẩn nội sinh bao gồm: cao, trung bình và thấp dựa trên cơ sở phân tích

đa dạng các loài xạ khuẩn trên đó Các tác giả cũng nhận định rằng các loài nội sinh đại diện cho sự đa dạng của các hợp chất có hoạt tính sinh học [23] Phần lớn các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ cao hơn các bộ phận khác trong cây El-Tarabily và Sivasithamparam (2006) ước tính mật độ xạ

khuẩn nuôi cấy được trong rễ cây dưa chuột (Cucummis sativus) và đỗ tương (Glycine max) đạt 105 CFU/g khối lượng củ/rễ tươi [25] Taechowisan và cộng sự (2003) đã phân tích tỉ lệ xạ khuẩn theo vị tr cư trú trên 36 loài dược liệu khác nhau dựa trên hình thái học và đặc điểm sinh lý sinh hóa, kết quả cho thấy: 64% phân lập

từ rễ, 29% từ thân và 6% từ lá [93] Trong khi đó, kết quả của Verma và cộng sự

(2009) cho thấy xạ khuẩn phân lập từ cây Azadirachta indica có tỷ lệ phân bố ở

thân và lá xấp xỉ nhau (23,6% và 21,8%) [100] Số lượng các chủng nhỏ hơn thường đến từ lá [109] và trong một vài nghiên cứu khác, không có xạ khuẩn nào được tìm thấy ở lá [6]

Những hiểu biết về sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh không chỉ giúp ích trong việc tìm kiếm và sàng lọc những chủng có lợi mà còn giúp các nhà khoa học hiểu rõ vai trò chúng trong hệ sinh thái Strobel và Daisy (2003) cho rằng sự đa

dạng lớn nhất của xạ khuẩn nội sinh diễn ra ở khu vực nhiệt đới và khu vực có nhiệt

độ ấm [90] Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rừng nhiệt đới sở hữu sự đa dạng sinh học lớn nhất trên thế giới về tài nguyên thiên nhiên và vi sinh vật nội sinh Tại rừng nhiệt đới Xishuangbanna của Trung Quốc, bằng nhiều phương pháp khác nhau, Qin

và cộng sự (2009) đã thu nhận 2174 chủng xạ khuẩn trên các môi trường phân lập,

từ 90 loại cây dược liệu, các chủng này thuộc 32 chi và có 19 loài mới Trong đó,

một chi mới và bảy loài mới được phân lập trên cây Maytenus austroyunnanensis

[75] Trong khoảng 10 năm (2001-2011), các nhà khoa học thuộc Viện Vi sinh vật học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ưu hóa các điều kiện phân lập và đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ khuẩn nội sinh thu nhận được từ hơn 100 loài thực vật Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn này sinh ra được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh học, kháng vi sinh vật, kháng tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất k ch th ch sinh trưởng,… Rõ ràng, tại rừng nhiệt đới có nguồn xạ khuẩn phong phú và đa dạng hơn nhiều so với các khu vực khác và hứa hẹn là nguồn phát hiện các chủng xạ khuẩn mới Xạ khuẩn nội sinh rất đa dạng và mức độ đa dạng có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau Sự đa dạng về loài và số lượng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phân lập [76]

1.4 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc

liệu

Theo thống kê gần đây, có hơn 10.000 chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc

vi sinh vật đã được phát hiện Nguồn thuốc kháng sinh chủ yếu xuất phát từ các sản phẩm trao đổi chất tự nhiên của xạ khuẩn hoặc nấm Trong tổng số các kháng sinh được sử dụng hiện nay, hơn 90% có nguồn gốc từ xạ khuẩn Khoảng 2/3 tổng số các hợp chất có hoạt tính sinh học được phát hiện có nguồn gốc từ chúng [37] Do đó,

xạ khuẩn nội sinh trở thành các đối tượng được nghiên cứu và quan tâm nhiều trong bối cảnh hiện nay

1.4.1 Kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh

Kháng sinh là thuốc quan trọng được sử dụng rộng rãi trong chăm sóc sức khoẻ cộng đồng và xạ khuẩn nội sinh là các ―nhà máy‖ tiềm năng để sản xuất chúng Nhiều loài xạ khuẩn nội sinh có nguồn gốc từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc giết chết nhiều vi sinh vật gây hại như vi khuẩn gây bệnh, nấm và virus

Do đó, chúng có giá trị cao trong việc ứng dụng để sàng lọc và phát triển các thuốc kháng sinh Cho đến nay, nhiều kháng sinh mới đã được khám phá như munumbicins A-D [11], celastramycin A-B [74], kakadumycins [12] và demethylnovobiocins [41] Munumbicins là kháng sinh có hiệu quả trong việc điều

trị bệnh do nhiễm khuẩn than (Bacillus anthracis) và khuẩn lao (Mycobacterium

tuberculosis) [11, 13] Kakadumycins - một kháng sinh nhóm peptide được tổng

hợp bởi Streptomyces sp 30566 nội sinh trên cây Kennedia nigriscans, có hoạt tính kháng vi khuẩn B anthracis với giá trị MIC 0,2-0,3 µg/ml (Minimum Inhibitory

Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu) [12] Hợp chất coronamycin được thu

nhận từ Streptomyces NRRL 30562 có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thuộc họ Pythiaceae (MIC 2 µg/ml) và nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh ở người

(MIC 4 µg/ml) [26] Hai hợp chất mới cedarmycin A và B được thu nhận từ chủng

Streptomyces sp TP-A0456 phân lập từ cây tuyết tùng (Cryptomeria japonica)

Theo đó, cedarmycin A thể hiện hoạt tính kháng nấm Candida glabrata trong điều kiện in vitro với giá trị MIC 0,4 μg/ml [41] Chủng Streptomyces sp Tc022 được phân lập từ rễ cây riềng nếp (Alpinia galanga) có hoạt tính ức chế mạnh hai loại nấm gây bệnh là Colletotrichum musae và Candida albicans Nhóm nghiên đã cứu tiến hành tách chiết môi trường nuôi cấy chủng Streptomyces sp Tc022 và thu được

hợp chất có thành phần chính là actinomycin D - một hợp chất có hoạt tính kháng nấm rất mạnh [94] Năm 2006, Castillo và cộng sự đã phát hiện hai kháng sinh mới

có tên là munumbicins E-4 và E-5 từ Streptomyces sp NRRL 30562 có hoạt tính

kháng nhiều loại vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) [13] El-Gendy và EL-Bondkly (2010) tìm thấy hợp chất saadamycin trong môi trường nuôi cấy chủng

Streptomyces sp Hedaya48 có khả năng kháng nấm gây bệnh hắc lào và một số

nấm gây bệnh khác [20] Gần đây, maklamycin - một polyketide kháng khuẩn được

tìm thấy môi trường nuôi cấy của Micromonospora phân lập từ cây Abrus pulcellus

(một loại dược liệu truyền thống Thái Lan) có hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn Gram (+) ở nồng độ 2-13 µg/ml [43] Những nghiên cứu được liệt kê trên đây đã củng cố giả thiết rằng các xạ khuẩn nội sinh là một nguồn tiềm năng của các chất kháng sinh

1.4.2 Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp chất trao đổi

thứ cấp

Polyketide và nonribosomal peptide là những hợp chất được hình thành trong qua trình trao đổi chất thứ cấp, có mặt ở nhiều loại sinh vật như: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và thực vật [27] Một số sản phẩm tiêu biểu thuộc nhóm polyketide như: kháng sinh nhóm macrolide (erythromycin, azithromycin), nhóm polyen (amphotericin), chất ức chế miễn dịch FK506, thuốc giảm cholesterol lovastatin, thuốc kháng ung thư doxorubicin; và thuộc nhóm nonribosomal peptide như kháng sinh vancomycin, gramicidin, thuốc ức chế miễn dịch cyclosprorin A [63] Polyketide và nonribosomal peptide là sản phẩm của chuỗi phản ứng tổng hợp do một hay nhiều enzyme đặc hiệu chịu trách nhiệm, đó là enzyme polyketide synthase (PKS) hoặc nonribosomal peptide synthetase (NRPS)

Hỗn hợp polyketide được hình thành dựa trên quá trình ngưng kết từ các đơn

vị acetate, propionate, acyl butyrate và khử nhóm β−carbonyl Trong tổng hợp polyketide, các polyketide khác nhau được hình thành từ một hoặc nhiều quá trình ngưng tụ Các gen mã hóa enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp tạo sản phẩm

cuối cùng gọi là polyketide synthase I (pks-I) [62] Các polyketide đa v ng thơm

được hình thành chủ yếu từ quá trình ngưng kết acyl acetate và nhóm β−carbonyl Oxytetracycline, actinorhodin và anthracycline là các nhóm hợp chất kháng sinh, kháng ung thư đa v ng thơm được tạo thành từ quá trình trên Gen mã hóa enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp polyketide đa v ng thơm chủ yếu là polyketide

synthase II (pks-II) [33] NRPS là nhóm enzyme có khối lượng phân tử lớn với các

phần đặc hiệu, kết hợp các chuỗi axit amin sẵn có trong một trình tự thành một chuỗi peptide để tạo thành các hợp chất nhóm nonribosomal peptide Nhóm gen

nrps mã hóa cho một loạt các enzyme NRPS để tổng hợp các nonribosomal peptide

bao gồm kháng sinh, độc tố, siderophores [83]

1.5 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ở Việt Nam

Do xạ khuẩn nội sinh có tiềm năng lớn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nên gần đây, ở Việt Nam, đối tượng vi sinh vật này đang được một số nhóm nghiên cứu quan tâm Nhưng nhìn chung, các công bố về vi sinh vật nội sinh nói chung và xạ khuẩn nội sinh nói riêng hiện chưa nhiều Một số nghiên cứu trong những năm gần đây có thể được tóm tắt như sau:

Năm 2014, Quách Ngọc Tùng và cộng sự đã phân lập được 78 chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mẫu cây quế thu thập tại xã Thung Nai, huyện Cao Phong, tỉnh H a Bình Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật các chủng xạ khuẩn phân lập được cho thấy 16 chủng có khả năng kháng ít nhất một loại vi sinh vật kiểm định được thử [3] Năm 2015, Nhan K.T và cộng sự đã nghiên cứu và công bố chủng

Streptomyces sp HUST012 phân lập từ cây Long huyết (Dracaena cochinchinensis Lour ) thu thập tại Cúc Phương, Ninh Bình, có khả năng kháng vi

sinh vật phổ rộng và ức chế mạnh sự phát triển của các dòng tế bào ung thư Hep G2, MCF-7 [97]

Năm 2016, Phan Thị Hồng Thảo và cộng sự đã phân lập được 45 chủng xạ khuẩn nội sinh trên 10 mẫu cây bưởi Diễn thu thập tại Hà Nội, trong đó xạ khuẩn nội sinh thu được ở các mẫu rễ có số lượng khuẩn lạc xạ khuẩn thu được (19 chủng chiếm 42,2%) nhiều hơn và đa dạng hơn các mẫu cành (12 chủng chiếm 26,6%) và mẫu lá (14 chủng chiếm 31,1%) Trong số 45 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có

12 chủng thể hiện khả năng kháng t nhất một trong các chủng vi sinh vật kiểm định (chiếm 26,67%) Trong số đó chủng HNR3X4 (xạ khuẩn nội sinh tách từ rễ) thể hiện khả năng đối kháng với nhiều chủng vi sinh vật kiểm định đặc biệt với vi

khuẩn Gram (+) S aureus ATCC 25922 và Bacillus subtilis ATCC 6633 [2]

Năm 2017, Salam và cộng sự đã phân lập được 98 chủng xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Cúc Phương, Ninh Bình và 33 chủng xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Bạch Mã, Thừa Thiên Huế Kết quả nghiên cứu cho thấy những chủng xạ khuẩn này có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và sinh độc tố Đặc biệt, chủng HUST001 còn có khả năng ức chế 2 dòng tế bào ung thư là MCF-7 và Hep G2, rất có tiềm năng sản xuất ra loại thuốc mới chống ung thư [80]

Theo thống kê của Viện Dược liệu, Việt Nam đã phát hiện 4.000 loài cây thuốc, trong đó có nhiều loại dược liệu được thế giới công nhận như cây Màng tang, hồi, quế, atiso, sâm Ngọc Linh, Cho đến nay, dù đã có nhiều nghiên cứu về tinh dầu và các hợp chất từ cây Màng tang, nhưng những nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang vẫn còn rất hạn chế

1.6 Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh

Cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) hay còn gọi là sơn kê tiêu, mọc

hoang ở các vùng núi cao của Hà Giang, Yên Bái, Điện Biên, Thanh Hóa, Gia Lai, Kon Tum, Màng tang là một vị thuốc được dùng để chữa cảm lạnh, nhức đầu, tê thấp, nhức xương tay chân tê dại Quả được dùng làm thuốc bổ dạ dày, thông tiêu hóa và chữa bệnh đau đầu Rễ và lá dùng để chữa rắn cắn, trị nhọt, viêm mủ trên da,… [1]

Tinh dầu Màng tang được chứng minh có khả năng kháng nhiều loại vi

khuẩn gây bệnh như B subtilis, Enterococcus faecalis, S aureus, E coli và nấm như Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris, Colletotrichum

gloeosporioides [59] Năm 2010, Ho và cộng sự có công bố đầu tiên xác định 50

hợp chất từ quả Màng tang thu thập tại Đài Loan, chất citral chiếm 68,9% tinh dầu chiết xuất từ quả và ức chế các dòng tế bào ung thư OEC-M1, J5, A549 với giá trị

IC50 đạt lần lượt 50, 50 và 100 ppm [40] Zhang và cộng sự (2012) đã tách chiết 5 hợp chất mới có khả năng kháng khuẩn thuộc nhóm isoquinoline alkaloid có độ tinh sạch > 90% từ thân cây Màng tang thu thập tại Quý Châu, Trung Quốc Ngoài khả

năng kháng vi khuẩn S aureus và nấm gây bệnh (A alternata và C nicotianae), hai

hợp chất là N-norbulbodione và N-norisocorydione có hoạt tính ức chế 6 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 đạt lần lượt 9,54-12,22 µM và 9,83-11,96 µM [107] Các hợp chất chiết xuất từ quả Màng

(+)-N-methoxylcarbonyl-tang được chứng minh có hoạt tính kháng vi khuẩn Streptococcus mutans,

Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguinis gây sâu răng và kìm hãm quá trình

hỏng của thực phẩm, hạn chế sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư gan, phổi

và ung thư vú [108]

Ở Việt Nam, những năm gần đây, một số công trình nghiên cứu liên quan đến cây Màng tang và ứng dụng của nó đã được công bố Năm 2015, Vũ Thu Trang

và Nguyễn Thị Hoa đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn S aureus của 7 loại

tinh dầu thực vật Việt Nam khi sử dụng riêng lẻ và kếp hợp Trong các loại tinh dầu

sử dụng, Màng tang và Quế chi thể hiện hoạt tính kháng S aureus vượt trội Bên

cạnh đó, các tinh dầu Màng tang, Quế chi, dầu Giun thể hiện khả năng kháng khuẩn cộng hưởng mạnh với nhau hứa hẹn tiềm năng ứng dụng cao khi sử dụng kết hợp hai trong ba loại tinh dầu này trong lĩnh vực y dược và thực phẩm [5] Van N.H và cộng sự (2016) công bố tinh dầu của các mẫu Màng tang thu thập tại miền Bắc Việt

Nam có hoạt tính kháng các loại vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Edwarsiella

tarda, Vibrio furnissii, Vibrio parahaemolyticus, Streptococcus garvieae, E coli, S typhimurium với MIC dao động từ 0,72-2,89 mg/ml Sau khi nhiễm A hydrophila,

tỷ lệ sống sót của cá chép được cho ăn với liều 4% và 8% bột lá cao hơn đáng kể so với liều 2% và đối chứng (0%) Ngoài ra, bột lá Màng tang làm tăng khả năng miễn

dịch không đặc hiệu của cá chép (Cyprinus carpio) Sự gia tăng có ý nghĩa của

lysozyme trong huyết tương đối với tất cả các nhóm thí nghiệm Hoạt tính tan huyết cao hơn ở nhóm ăn 4% và 8% bột lá Màng tang Hoạt tính kháng khuẩn của huyết tương tăng đáng kể với liều 8% Tác giả cho rằng, các chế độ ăn bổ sung 4-8% bột

lá Màng tang có thể được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản để giảm kháng sinh và

tác động của các bệnh do A hydrophila [99]

Năm 2016, Trịnh Thị Trang và cộng sự đã phân lập được 32 chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Hà Tây, Ninh Bình Kết quả nghiên cứu cho thấy có 9 trong tổng số 32 chủng phân lập được thể

hiện khả năng đối kháng với 3 chủng vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila GL14, Aeromonas caviae HD60 và Streptococcus agalactiae HY10 gây bệnh trên

cá chép và cá rô phi Ba chủng MTR711, MTR622 và MTL121 có tính kháng khuẩn mạnh nhất với giá trị MIC dao động từ 93,3-300,0 µl/mL Tác giả cũng nhận định, kết quả nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trong báo cáo này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về các hợp chất kháng khuẩn sinh học ứng dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên các đối tượng thủy sản [4]

Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ Một số giả thuyết nhận định rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học được tiếp nhận từ quá trình trao đổi chất giữa vi sinh vật và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer) Nhờ đó các nhà vi sinh vật học đã mở ra triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học

có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy vi sinh vật Ví dụ như chất kháng tế

bào ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp và một số nấm nội sinh khác [57] Hai hợp 5, 7-dimetoxy-

4-phenylcoumarin và 5, 7-dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, thường thu nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau

Nhưng gần đây, hai hợp chất này cũng được tìm thấy trong loài S aureofaciens

CMUAc130 nội sinh [92]

Cho đến nay, trên thế giới cũng như Việt Nam, nhiều nghiên cứu về tinh dầu Màng tang và hoạt tính sinh học đáng quý của nó đã được công bố, nhưng nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang còn hạn chế Do vậy, việc nghiên cứu

về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang trong đề tài này nhằm tìm kiếm các chủng

có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mới và giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các nhà khoa học trong và ngoài nước

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật

Mẫu cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) được thu thập tại xã Quang

Trung, huyện Ngọc Lặc, tỉnh Thanh Hoá (20o13’34’’N; 105o39’50’’E); núi Hàm Lợn, Sóc Sơn, Hà Nội (21o30’39’’N; 105o79’92’’E) và xã Cấp Dẫn, huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ, Việt Nam (21o24’25’’N;105o04’05’’E) vào tháng 01 năm 2016

Mẫu thực vật đã được khẳng định là loài Litsea cubeba (Lour.) Pers bởi TS

Nguyễn Thế Cường tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC 11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas aeruginosa CNLM, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sưu

tập giống vi sinh vật của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ), cao nấm men (Himedia-Ấn Độ), raffinose (Chameleon, Nhật Bản), trehalose (Chameleon, Nhật Bản), sodium dodecyl sulfate (SDS), ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ), phenol, methanol, isoamylalcohol, EtBr, glycerol, ethanol, chloroform, ampicillin, acrylamide, (Merck, Đức), agar (Fluka, Đức), d-NTP (Fermentas, Mỹ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose của Thermo scientific (Mỹ); enzyme: RNAase, Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ)

Thiết bị nghiên cứu: Tủ cấy vô trùng (ESCO, Singapore), máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh

(Biofuge fresco, Kendro, Đức), máy điện di DNA (Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy UV (PowerPac Basic, Bio-Rad, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt (BSI-25R CPT, Mỹ) và một số thiết bị nghiên cứu khác

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong lưu giữ giống, phân lập và xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh được trình bày trong Phụ lục 1

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu

Thu thập mẫu: Mẫu cây Màng tang được lấy bằng dao đã khử trùng và lưu giữ trong các túi nilon Mẫu được chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu và bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi tiến hành th nghiệm trong vòng 20 ngày

Chuẩn bị mẫu: Mẫu cây Màng tang được rửa sạch dưới v i nước để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu tại nhiệt độ ph ng trong 20 phút Các mẫu được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) trong 5 phút Rửa mẫu một lần bằng Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dư Tiếp tục xử lý mẫu bằng Ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng để loại bỏ Ethanol [60]

2.2.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Màng tang

Các mẫu cây Màng tang sau khi khử trùng bề mặt được làm khô, nghiền nhỏ trong tủ cấy vô trùng sau đó cấy trải trên 8 môi trường phân lập (Phụ lục 1) bao gồm: TWYE [16], HV [39], ISP5 [85], STA, TA, SA, SPA, CA [75], theo quy trình được mô tả bởi Li và cộng sự (2012), sau đó nuôi ở 28o

C trong 6-8 tuần Để hạn chế

sự phát triển của vi khuẩn và nấm, các môi trường được bổ sung axit nalidixic (50 mg/l) và nystatin (50 mg/l) Các khuẩn lạc đặc trưng được cấy tinh sạch trên trên môi trường YIM38 [55] Đặc điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc được quan sát sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường (ISP2) [85]

2.2.3 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt t nh kháng vi sinh vật kiểm định

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường YIM38 lỏng ở 30oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút, sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút thu dịch lên men sử dụng cho thử nghiệm tính kháng khuẩn Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh được xác định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch kết hợp hiệu chỉnh theo Hadacek và cộng sự (2000) [37] Vi sinh vật kiểm định với mật độ 108 (cfu/ml) được gạt đều trên đĩa thạch chứa môi trường LBA sau đó đục lỗ thạch, nhỏ 100 µl dịch nuôi cấy xạ khuẩn vào lỗ thạch, vòng kháng khuẩn được quan sát sau 18h nuôi ở 30oC Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo k ch thước vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:

Vkk = D - d (mm), Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm)

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28

2.2.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn được quan sát, so sánh khi nuôi cấy các chủng trên các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-

30oC Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb (1966) và so sánh trên bảng màu của Tresner và Danga (1958) [85, 98]

- Màu sắc của KTKS: Được so với 7 nhóm màu bao gồm xanh da trời, nâu, xám, đỏ, tím, trắng, vàng

- Màu sắc của KTCC: Chia vào 5 nhóm vàng – nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố), xanh da trời, xanh lá, đỏ – da cam, tím

- Khả năng sinh sắc tố tan: được xác định trên môi trường ISP2, ISP5 Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ da cam, tím

- Sự hình thành sắc tố melanin: xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ 30°C Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen

2.2.4.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử

- Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP3 và ISP4 có đặt lamen trên mặt đĩa Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-30oC, các đĩa th nghiệm được lấy

ra để quan sát hình dạng chuỗi bào tử dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét

- Hình dạng chuỗi bào tử được ký hiệu: RF (thẳng hay hơi lượn sóng), RA (hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn), S (dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn), SRF (dạng xoắn lượn sóng), SRA (dạng xoắn có móc câu) [73].

- Bề mặt bào tử: các mẫu được đông khô, sau đó được mạ vàng bằng máy JFC-1200, quan sát và chụp trên kính hiển vị điện tử quét (JSM-5410; JEOL, Tokyo) với điện áp là 15 kV để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: Sm (trơn nhẵn), sp (gai),

wa (xù xì), ru (nếp nhăn), ha (tóc) [73]

2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

Đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng xạ khuẩn MPT28 được xác định theo phương pháp của Garrity và Holt, 2001 [30] như sau:

- Khả năng sử dụng nguồn cacbon: Xạ khuẩn được nuôi ở nhiệt độ 28-30oC trên môi trường ISP9 có bổ sung các nguồn đường (1,0%, w/v): D-Glucose, D-Glactose, D-Mantose, L-Arabinose, α-Lactose, myo-Inositol, D-Manitol, D-Fructose, L-Rhamnose D-Saccharnose, D-Sorbitol, D-Trehalose Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trưởng và so sánh với môi trường có nguồn cacbon là D-Glucose

(đối chứng dương) và không có nguồn cacbon (đối chứng âm)