Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài: Kháng sinh trong tôm và cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Viện CNSH & CNTP Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài: Kháng sinh tơm cá tra GVHD: TS Lê Quang Hịa Nhóm SV: Đặng Phương Anh - 20160050 Trần Thị Nga - 20162880 Nguyễn Thị Bích Liên - 20162361 Nội dung 01 Thực trạng sử dụng kháng sinh nuôi trồng thủy sản 02 Các phương pháp phát nhanh kháng sinh tôm, cá tra 03 Kết luận Sunshine Phần 感感感感感感感感感感感感感感 PPT 感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感 ibaotu.com Thực trạng sử dụng kháng sinh nuôi trồng thủy sản Chất kháng sinh? Nguồn gốc tự nhiên tổng hợp điều kiện nhân tạo Phân loại theo chế tác động: + Diệt khuẩn + Ức chế khuẩn Có khả tiêu diệt kìm hãm vi sinh vật Dùng để trị bệnh nhiễm khuẩn cho người, vật nuôi trồng Một số nhóm kháng sinh phép sử dụng cho mục đích ni trồng thủy sản, bao gồm: Tetracycline; Quinolones; Macrolides; Sulphonamides DANH MỤC THUỐC THÚ Y CẤM SỬ DỤNG ( Ban hành kèm theo Thông tư số 40 /2016/TT-BNNPTNT ngày 01 tháng, năm 2016 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) STT 10 11 Tên hóa chất, kháng sinh Aristolochia spp chế phẩm từ chúng Chloramphenicol Chloroform  Chlorpromazine Colchicine Dapsone Dimetridazole Metronidazole Nitrofuran (bao gồm Furazolidone) Ronidazole Green Malachite (Xanh Malachite) 感感感感感感感感感感感感感感 PPT 感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感 ibaotu.com 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Ipronidazole  Các Nitroimidazole khác Clenbuterol Diethylstilbestrol (DES) Glycopeptides Trichlorfon (Dipterex) Gentian Violet (Crystal violet) Trifluralin Cypermethrin Deltamethrin Enrofloxacin Ciprofloxacin Nhóm Fluoroquinolones Hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng sản xuất, kinh doanh động vật thủy sản 感感感感感感感感感感感感感感 PPT 感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感 ibaotu.com Thực trạng sử dụng kháng sinh tôm, cá tra EU &Austrailia 10 tháng đầu năm 2015, 8.000 philê cá tra đông lạnh xuất sang EU Australia bị loại dư lượng kháng sinh vi sinh vật vượt mức cho phép Nhật Bản tháng đầu năm 2015, 27 lô sản phẩm thủy sản xuất sang Nhật bị từ chối lượng dư lượng kháng sinh cao Việt Nam Hoa Kỳ 35 đợt tôm bị từ chối thời gian, gấp lần so với số lượng bị từ chối năm 2014 2019-tỷ lệ mẫu giám sát vi phạm quy định thuốc bảo vệ thực vật, hóa chất, kháng sinh cấm giảm 10% so với năm 2018 Tác hại dư lượng kháng sinh 感感感感感感感感感感感感感感 PPT 感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感 ibaotu.com Các phương pháp phát nhanh kháng sinh tôm, cá tra Phần Kit, Test thử nhanh Phát dư lượng kháng sinh thủy sản Phản ứng Elisa Thêm 50 uL Chloramphenicol tiêu chuẩn vào giếng( cho từ nồng độ thấp đến cao) Thêm 50uL mẫu vào giếng Thêm 100 uL kháng thể số vào giếng trộn cách lắc nhẹ đĩa tay phút Ủ đĩa 30 phút nhiệt độ phòng Rửa đĩa lần với 250uL x Wash Solution Sau lần rửa cuối cùng, đảo ngược đĩa gõ nhẹ vào đĩa khô khăn giấy Thêm 150 uL kháng thể thứ cấp Ủ 30 phút nhiệt độ thường Rửa đĩa lần với 250uL x Wash Solution Sau lần rửa cuối cùng, đảo ngược đĩa gõ nhẹ vào đĩa khô khăn giấy Thêm 100 uL chất TMB Trộn đều, ủ 15 phút nhiệt độ phòng Thêm 100 ul stop buffer để dừng phản ứng enzyme Đọc kết bước sóng 450nm Đọc kết Giới hạn phát mẫu (0,05 ng / g ppb) x (hệ số pha loãng) Giới hạn định lượng mẫu (0,15 ng / g ppb) x (hệ số pha loãng) Elisa cạnh tranh NHƯỢC ĐIỂM ƯU ĐIỂM • Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, nhanh • Chi phí thấp kiểm đồng thời số lượng mẫu lớn • Độ nhạy cao (0,05 ppb) giới hạn phát thấp (0,025 ppb) • Là sinh phẩm nên số hố chất phải bảo quản lạnh có hạn sử dụng định • Địi hỏi tay nghề tốt -> Phạm vi xác định: Thích hợp cho mẫu phức tạp, kháng ngun khơng địi hỏi tinh trước tiến hành phản ứng Phát nhanh chóng dư lượng Chloramphenicol sản phẩm thủy sản cách sử dụng xét nghiệm miễn dịch sắc ký vàng keo Xét nghiệm sắc ký miễn dịch vàng keo (GICA) phát triển để phát nhanh chóng dư lượng chloramphenicol (CAP) sản phẩm thủy sản + Một màng nitrocellulose (NC) sử dụng làm chất mang kháng thể CAP đa dòng sử dụng làm protein đánh dấu Giới thiệu  + Đường kính trung bình hạt nano vàng keo chuẩn bị (AuNPs) khoảng 20nm.  + Giá trị pH tối ưu dung dịch vàng keo lượng kháng thể CAP 8,0 7,2 μg / mL.  + Kháng thể CAP cố định vào miếng đệm liên hợp sau tinh chế. IgG liên hợp kháng thể IgG (kháng thể thứ cấp) dê phủ lên màng NC. Tiếp theo, trang web không đặc hiệu bị chặn với albumin huyết 1% Các dải sắc ký miễn dịch vàng keo cạnh tranh với độ nhạy cao, phản ứng nhanh chi phí thấp để phát dư lượng CAP Vật liệu phương pháp Nguyê n vật liệu Kháng thể Polyclonal chloramphenicol (CAP), chloramphenicol IgG; Axit chloroauric (HAuCl 4 · 3H 2 O) Albumin huyết bò (BSA). PEG20000 tinh khiết phân tích, sucrose Tween-20 áp dụng thí nghiệm  Màng nitrocellulose (Millipore 135), màng sợi, miếng thấm  Các hóa chất khác sử dụng loại phân tích Thiết bị Máy quang phổ UV-2450.  - Tất nước cất sử dụng tinh lọc hệ thống nước siêu tinh khiết - Một máy khuấy -  Một máy ly tâm đông lạnh tốc độ cao (H3018DR) - Một kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) -  Máy phân tích hạt nano sử dụng để đo kích thước AuNPs.  - Một chất tẩy rửa siêu âm (KQ-500B) dụng cụ nghiền tế bào siêu âm (BILON92-ⅡDL) Cách tiến hành Tổng hợp vàng keo Chuẩn bị thăm dị keo vàng • Dung dịch axit chloroauric (50 ml 0,01% (W / V) HAuCl 4 · 3H 2O) đun nóng đến điểm sôi (110 ° C), thêm vào dung dịch natri citrat ml 1,0% (W / V). Khuấy tiếp tục đun màu dung dịch chuyển từ màu vàng rơm sang màu đỏ tươi • Dung dịch kháng thể đa dòng CAP (1 mg / mL) điều chế cách sử dụng PBS khử trùng (0,001 mol / L, pH 7,4), sau cho vào túi lọc máu để tinh chế, thẩm tách ° C dung dịch nước NaCl 0,005 mol / L •  Các màng lọc thay 2-3 lần giai đoạn ban đầu trình lọc máu để loại bỏ ion muối dư thừa.  • Dung dịch thu được ly tâm 10.000 vòng / phút 60 phút ° C để có phần phía rõ ràng cho liên hợp.  • Độ pH tối ưu vàng keo cho liên hợp kháng thể điều chỉnh cách thêm giọt 0,1 mol / LK 2 CO 3dung dịch nước. Với việc khuấy nhẹ, dung dịch kháng thể thêm giọt vào dung dịch vàng keo (20 mL) • Để loại bỏ kháng thể dư, hỗn hợp phản ứng ly tâm tốc độ 1500 vòng / phút 10 phút sau mức 13.000 vịng / phút 60 phút ° C •   Việc ly tâm lặp lại đến lần, sau bảo quản ° C sử dụng Tối ưu hóa độ pH cho kết hợp •- Dung dịch vàng keo 500 μL đưa vào ống Eppendorf với 0, 10, 20, 40, 60, 80 100 L 0,1 mol / LK 2 CO 3 được thêm vào để thu dung dịch có giá trị pH khác •- Dung dịch kháng thể mg / mL (5 L) thêm giọt vào dung dịch thu (200 L) tương ứng •- Phản ứng 10 phút15 phút, ống nhận 50 μL NaCl 10%. Năm phút sau, độ hấp thụ dung dịch đo máy quang phổ UV Chuẩn bị dải miễn dịch Cấu trúc dải miễn dịch: • Điểm tra mẫu • Cộng hợp phát hiện: Kháng nguyên gắn hạt có màu (hạt nano vàng nanocacbon) • Vạch thử nghiệm: Cố định kháng thể có khả bắt cặp với kháng nguyên cần phát • Vạch kiểm chứng: Kháng thể kháng kháng thể Chuẩn bị dải miễn dịch • Đầu tiên, màng nitrocellulose (NC) gắn trực tiếp vào trung tâm thẻ PVC • Thứ hai, cộng hợp phát có gắn hạt vàng keo đặt vào đầu màng NC. Một miếng thấm sau thêm vào đầu màng NC • Một miếng đệm mẫu đặt vào bên cạnh miếng đệm liên hợp xa màng NC.  • Sau đó, tồn dải làm phẳng để chất lỏng mẫu chảy thành công qua vật liệu khác dải •  Cuối cùng, kháng thể CAP-BSA phun lên vạch thử nghiệm (dòng T) dòng kiểm chứng (dòng C) màng NC Chuẩn bị dải miễn dịch Nguyên tắc • Dung dịch mẫu đổ vào miếng đệm mẫu kháng thể có nhãn vàng thêm vào miếng liên hợp vàng •  Kháng thể di chuyển lên tác động lực mao dẫn. Khi liên hợp kháng thể AuNPs-keo đến vạch thử nghiệm, kháng nguyên phủ cạnh tranh với kháng nguyên phân tích mẫu để gắn vào vị trí cụ thể kháng thể dán nhãn vàng •  Nếu có kháng nguyên mẫu, thu nhiều kháng thể có nhãn vàng vạch thử nghiệm (T), xuất vạch màu đỏ vạch thử T (kết âm tính) •  Mặt khác, tín hiệu so màu tạo hạt nano vàng bị giữ lại giảm nồng độ kháng nguyên phân tích tăng lên, đó, vạch thử T khơng chuyển sang màu đỏ (kết dương tính) Kết thảo luận Ảnh TEM hạt nano vàng 20nm Quang phổ vàng keo ( vạch đỏ) liên hợp kháng thể- vàng keo (vạch xanh) Kết luận •Thời gian phân tích cho xét nghiệm CAP vịng 10 phút Do đó, phương pháp sử dụng để phát nhanh chóng chỗ dư lượng CAP sản phẩm thủy sản •Nồng độ tối thiểu phát dư lượng CAP cá sử dụng dải thấp tới 0,5 μg / kg, với khả tái sản xuất tốt.  •Các dải có thời hạn sử dụng dài 90 ngày để sử dụng ứng dụng thực tế.  Tài liệu tham khảo Thông tư số 40 /2016/TT-BNNPTNT Alemu H and L Hlalele, 2007 Voltammetric determination of chloramphenicol at electrochemically pretreated glassy carbon electrode Bull Chem Soc Ethiop, 21: 1-12 Wed Nankai Biotech Co Http://www.boa.gov.vn/vi/phong-kiem-nghiem-2 5.https://www.researchgate.net/publication/26298266_Analysis_of_antibiotics_in_fish_samples https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758187/ Thanks for listenin g ... Thực trạng sử dụng kháng sinh tôm, cá tra EU &Austrailia 10 tháng đầu năm 2015, 8.000 philê cá tra đông lạnh xuất sang EU Australia bị loại dư lượng kháng sinh vi sinh vật vượt mức cho phép Nhật... lượng kháng sinh 感感感感感感感感感感感感感感 PPT 感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感感 ibaotu.com Các phương pháp phát nhanh kháng sinh tôm, cá tra Phần Kit, Test thử nhanh. .. gây hiền tượng kháng kháng sinh người Cần có phương pháp phân tích nhanh để kiểm sốt kịp thời dư lượng kháng sinh có thủy sản NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG ELISA •Dựa phản ứng kháng nguyên- kháng thể • Sử