Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài phát hiện nhanh Clostridium perfringens trong thực phẩm đóng hộp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm Phát nhanh Clostridium perfringens thực phẩm đóng hộp GVHD:TS.LÊ QUANG HÒA Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trang 20164164 Nguyễn Thị Anh Đào 20160891 Bùi Thị Quỳnh 20163454 Nội dung 01 Tổng quan C.Perfringens 02 Các phương pháp phát nhanh C.Perfringens 03 Kết luận ĐẶT VẤN ĐỀ • Theo bảng tiêu chuẩn C.Perfringens cho phép thực phẩm, Bộ y tế 4/1998 Nhóm đồ hộp khơng cho phép diện vi khuẩn • Ngộ độc thực phẩm Clostridium perfringens xảy phổ biến, chủ yếu liên quan đến loại đồ hộp ĐẶC ĐIỂM CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS - Là trực khuẩn gram (+) , có vỏ, sinh bào tử, khơng có tiên mao, kích thước 0,8 - 1x4 8μm - Thuộc loại vi khuẩn ôn nhiệt, nhiệt độ phát triển tối ưu 37- 45⁰C - Là vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh vi sinh vật - Không thể tăng trưởng MT có nồng độ muối NaCl từ 6-8% nhiệt độ nuôi cấy thấp 12⁰C ĐẶC ĐIỂM SINH HĨA C.PERFRINGENS • C perfringens có khả lên men loại đường glucose, lactose, saccharose • Làm đông tụ sữa, làm tan gelatin chúng sản sinh enzym gelatinase, tinh bột glycogen • C perfringens cịn có khả khử nitrate thành nitrite Vi khuẩn khơng có khả phá vỡ indole Phân loại C.Perfringens • C perfringens có khả tiết khoảng 20 loại độc tố, có độc tố alpha, beta, epsilon, iota • Được xếp thành nhóm C Perfringens nhóm A, B, C, D E • C perfringens nhóm A phổ biến tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Cịn nhóm C gây hoại tử ruột non TÁC HẠI GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Clostridium Perfringens nhóm A Clostridium Perfringens nhóm C - Tiêu chảy, đau thắt vùng bụng vòng - 24 - Một số gây tượng sốt - Chấm dứt sau 2-3 ngày, không gây tử vong - Nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy máu - Có thể bị viêm ruột, nhiễm trùng máu => Tử vong - Đau bụng cấp tính nơn mửa 8-16 NGUN NHÂN Đồ hộp: mơi trường kị khí Q trình chế biến, bảo quản PHƯƠNG PHÁP PCR P H ÁT H I Ệ N C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP PH ƯƠNG PH Á P ĐỂ X ÁC ĐỊNH C.PERF RI NGENS T RO NG ĐỒ H Ộ P: Phương pháp truyền Phương pháp thống ELISA Phương pháp PCR -Thời gian lâu, cần 3- -Cho kết nhanh ngày để phát độ nhạy cao -Đòi hỏi độ tinh cao -Tăng sinh  Độc tố  ảnh hưởng đến hiệu sử dụng -Độ nhạy đặc hiệu cao -Thời gian thực ngắn -Khơng địi hỏi độ tinh cao => Lựa chọn kĩ thuật PCR để phát C.Perfringens đồ hộp QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PCR Hóa chất dung cho phản ứng PCR + Đệm TE IX + Đệm PCR 10X + Nước cất + dNTP + Mồi (primer): cặp mồi sử dụng nghiên cứu PL3 Trình tự mồi PL3, PL7 (từ 5' - 3') sau: PL3 AAG TTA CCT TTG CTG CAT AAT CCC PL7 ATA GAT ACT CCA TAT CAT CCT GCT + Taq DNA polymerase Hóa chất dung cho điện di + Đệm tải mẫu điện di + Đệm TAE IX + Agarose + Thang DNA + Ethidium bromide QUY TRÌNH PHÁT H IỆN C.PERFRING ENS TRO NG ĐỒ HỘ P BẰNG PCR Mẫu thực phẩm 10g (10ml) + 90ml SPW Đồng mẫu Ủ tăng sinh 37o C qua đêm Giai đoạn 1: Tăng sinh tách chiết DNA Hút 1ml dịch tăng sinh vào Eppendorf, li tâm 5000 vòng/ phút phút Rửa sinh khối tế bào nước cất vơ trùng Li tâm 5000 vịng/phút phút để thu sinh khối tế bào Huyền phù sinh khối tế bào 100µl TE, xử lí nhiệt 100o C 10 phút Giai đoạn 2: Thực PCR khẳng định Li tâm 5000 vòng/phút phút, thu phần dịch bên Thực phản ứng PCR Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,2% Xử lí kết THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR Thành phần sử dụng phản ứng PCR phát Phản ứng PCR thực theo chương trình khuếch đại: +Biến tính DNA 95°C phút; +Phản ứng PCR gồm 35 chu kì, chu kì gồm bước: 94°C 30 giây, 55°C 40 giây, 72°C 45 giây QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PCR - Xử lí kết + Nếu xuất vạch tương đương với 283bp vạch chuẩn kết luận phản ứng PCR dương tính + Nếu khơng xuất vạch vạch có kích thước khác với 283bp kết luận âm tính - Vậy tổng thời gian cho tồn quy trình phát c perfringens khoảng 24 giơ; gồm khoảng 20 tăng sinh, thực phản ứng PCR xem kết quả, kể từ nhận mẫu khỉ cho kết PHẠM VI ỨNG DỤNG - Trong công nghệ sinh học, PCR sử dụng việc lập đồ gen, phát gen, dịng hóa gen, giải mã trình tự DNA - Trong y học: chẩn đoán bệnh ung thư, nghiên cứu hệ kháng nguyên bạch cầu người - Trong vi sinh học: phát tác nhân vi sinh gây bệnh trường hợp tác nhân nuôi cấy thường quy, tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết chậm, tác nhân nuôi cấy thất bại có mặt bệnh phẩm, bị điều trị kháng sinh trước - Ngồi PCR dung để xác định độc tố vi sinh vật, nghiên cứu tính kháng thuốc vi khuẩn PHƯƠNG PHÁP LAMP P H ÁT H I Ệ N C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP NGUYÊN TẮC - Kĩ thuật LAMP dựa vào tổng hợp DNA thay chuỗi tự xoay vòng thực DNA polymerase cặp mồi mồi thiết kế đặc biệt diễn 60-65 độ C khoảng 40-45 phút - Cặp mồi gồm mồi mồi xi (FIP) mồi ngược (BIP) Trình tự FIP BIP thiết kế sau: +FIP chứa F1c, đoạn TTTT trình tự F2 bổ sung với F2c +BIP chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, đoạn TTTT B2 - Hai đoạn mồi bổ sung cho đoạn B3c trình tự F3 bổ sung cho F3c - Cơ chế phản ứng LAMP gồm bước: + Bước : Tạo vật liệu khởi đầu + Bước 2: Chu kỳ tái kéo dài + Bước : Lặp lại chu kì QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP Hóa chất dung cho phản ứng LAMP - Enzym Bst polymerase - Đệm phản ứng - dNTP - Nước cất - Cặp mồi F3: 5’-ACATCTGCAGATAGCTTAGGAAAT-3’ B3: FIP: BIP: 5’-CCAGTAGCTGTAATTGTTAAGTGT-3’ 5’-AGCAGCTAAATCAAGGATTTCTTTTT AGGTTCATTAATTGAAACTGGTGA-3’ 5’-AACTGATGCATTAAACTCAAATCCAG AGGGTATGAGTTAGAAGAACGC-3’ QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP Thời gian thực Mẫu nghiên cứu Tách, chiết DNA DNA tách chiết từ mẫu Khoảng 30p Chạy lamp Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Thêm AND mẫu nghiên cứu Khuếch đại LAMP Phát hiện: Phát Khoảng 60 phút QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP Master mix 25 µl bao gồm: - 2,5 µl đệm 10X - 6mM MgS04 - 1,4 mM dNTP - 40 µM FIP 40 µM BIP - µM F3 µM B3 - 8U Bst Polymerase - µl template DNA Khuếch đại LAMP - Trong phản ứng ban đầu nước khơng có nuclease, đệm Bsm (× 10), hỗn hợp dNTP mẫu thêm vào ống ependorff với biến tính ban đầu 95 ° C phút - Sau làm lạnh mẫu 30 giây đến phút, mồi bên ngoài, mồi bên enzyme thêm vào - Phản ứng khuếch đại LAMP thực bể nước nóng 55 ° C 60 phút.Enzyme bất hoạt thực sau hoàn thành phản ứng 80 ° C 10 phút - Các sản phẩm LAMP khuếch đại lưu trữ −20 ° C QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP PHÁT HIỆN SẢN PHẨM LAMP - Cách đơn giản để phát sản phẩm phản ứng LAMP điện di gel agarose 1% Tương tự điện di, thêm trực tiếp EtBr vào ống thử phản ứng, sau soi tia UV Những mẫu dương tính phát quang, cịn ống âm tính độ sáng (do DNA mẫu DNA mồi) Một cách phát sản phẩm LAMP mắt thường sử dụng SYBR Green I Phản ứng sau diễn ra, bổ sung thêm 1% SYBR Green I Những mẫu dương tính cho màu xanh, cịn mẫu âm tính cho màu vàng chanh TÍNH ƯU VIỆT CỦA KĨ THUẬT LAMP SO VỚI PCR - LAMP phương pháp khuếch đại ADN mới, có độ đặc hiệu cao, độ nhạy độ nhanh phản ứng cao - Thời gian thực LAMP nhanh so với PCR Theo đó, thời gian thực PCR trung bình khoảng 2,5 – giờ, thời gian thực LAMP trung bình khoảng 1-1,5 Điều có ý nghĩa đặc biệt quan trọng việc chuẩn đoán xác định bệnh nhanh động vật, đặc biệt người - Kết phản ứng LAMP quan sát ánh sáng thường soi tia UV - Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị máy ln nhiệt chu trình nhiệt,hệ thống khơng cần đến lượng điện KẾT LUẬN - Do C.Perfrigens vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng nên việc phát nhanh để phòng chống đưa phương án chữa trị kip thời cần thiết - Hiện có nhiều phương pháp phát C.Perfringens, phương pháp có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên cần phải phát nhanh để đảm bảo thời gian sức khỏe Do chúng em lựa chọn phương pháp PCR LAMP TÀI LIỆU THAM KHẢO - https://123doc.org/document/3206154-xay-dung-quy-trinhphat-hien-clostridium-perfringens-trong-thuc-pham-bang-ki -thuat-pcr-polymerase-chain-reaction-va-thu-nghiem-ung-du ng.htm - https://vi.wikipedia.org/wiki/Clostridium_perfringens - https://aem.asm.org/content/aem/77/21/7526.full.pd f?fbclid=IwAR2ArSfNMuu7AOAKwxsjknEzbtKi_D44-lwD5nb a3VTbA83TgyaNAUtEDWk Thanks for your listening! ... dung 01 Tổng quan C .Perfringens 02 Các phương pháp phát nhanh C .Perfringens 03 Kết luận ĐẶT VẤN ĐỀ • Theo bảng tiêu chuẩn C .Perfringens cho phép thực phẩm, Bộ y tế 4/1998 Nhóm đồ hộp khơng cho phép... perfringens nhóm A phổ biến tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Cịn nhóm C gây hoại tử ruột non TÁC HẠI GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Clostridium Perfringens nhóm A Clostridium Perfringens nhóm C - Tiêu chảy, đau thắt... bị hỗn hợp phản ứng Thêm AND mẫu nghiên cứu Khuếch đại LAMP Phát hiện: Phát Khoảng 60 phút QUY TRÌNH PHÁT HIỆN C .PERFRINGENS TRONG ĐỒ HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP Master mix 25 µl bao gồm: - 2,5 µl