Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài: Phân tích nhanh STEC trong thực phẩm ăn liền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM PHÂN TÍCH NHANH CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: Phát nhanh STEC (Shiga toxin Producing E.coli) thực phẩm ăn liền GVHD: TS Lê Quang Hịa SVTH: Tạ Thạc Bình- 20160377 Nguyễn Thị Nương- 20163099 Nội dung 01 02 Tổng quan STEC Phương pháp phát nhanh STEC 03 Kết luận Phần 1: Tổng quan STEC   STEC bốn nhóm E coli gây bệnh truyền qua thực phẩm người Gây nhiễm trùng nguy hiểm với triệu chứng tiêu chảy nặng, xuất huyết đường ruột hội chứng tán huyết tăng urê máu (HUS)  Trong E coli O157:H7 kiểu huyết phổ biến vụ dịch giới Cơ chế gây bệnh: Tạo độc tố Stx mã hóa gene stx, với chế ức chế sinh tổng hợp protein tế bào dẫn tới chu trình chết tế bào Vi khuẩn E.coli chủng STEC Sự phát triển STEC phụ thuộc:     o o Nhiệt độ: đến 50 C, Topt=37 C pHopt: 6-7 Hoạt độ nước: W=0,95 Thành phần thực phẩm Shiga toxin Độc tố Shiga: Độc tố bền nhiệt Là protein có cấu trúc A1B5, trọng lượng phân tử 70kDa, bao gồm tiểu phần A tiểu phần B Tiểu phần A: có vai trị enzyme N-glycosidase cắt base Adenin vị trí 4324 tiểu phần 28S- rRNA thuộc ribosome 60s dẫn tới trình tổng hợp Pr tế bào bị nhiễm dừng lại Quá trình chết tế bào Tiểu phần B: Đưa độc tố vào tế bào chủ, có vị trí kết hợp với Glycolipit bề mặt tế bào đích tương tự cầu nối trung gian để tiểu phần A xâm nhập vào tế bào Shiga toxin 1:   Phân loại độc tố Shiga Được mã hóa gen stx1 Một số biến thể khác stx1 stx1c, stx1d stx1c khơng tìm thấy STEC Stx1 STEC có trình tự acid amin tương đồng với Stx, độc tố tìm thấy Shigella sonnei Shigella dysenteriae Shiga toxin 2: Được mã hóa gen stx2, số biến thể stx2b,stx2c, stx2d có stx2c tìm thấy E.coli O157.H7 Phương pháp Elisa Sandwich phát kháng nguyên lông Ecoli O157 :H7 Nguyên tắc Elisa Thành phần phản ứng Elisa Kháng thể đa dịng chế qua thỏ (Pab) có hàm lượng 16mg/ml Mẫu thực phẩm nghi nhiễm Hai kháng thể đơn dịng ký hiệu A10.16.I Mab C3.26.IV có hàm lượng tương ứng 12mg/ml 11,8mg/ml Kháng thể thứu cấp kháng IgG chuột đánh dấu enzyme alkaline photphatase Cơ chất Alkaline phosphatase Thiết lập phản ứng Elisa sandwich Phủ giếng kháng thể đa dòng từ thỏ kháng KN H7 o Mẫu thực phẩm nghi nhiễm tăng sinh m TSB 40 C/10h Thêm kháng thể đơn dòng từ chuột kháng KN H7 Bổ sung kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột đánh dấu alkaline photphatase Thêm chất Alkaline phosphatase vào giếng Ủ tối đo OD 405nm Quy trình phát Elisa Sandwich 25 mẫu thịt bò/ 25ml sữa Dập mẫu Tăng sinh mTSB o o 41 C/8h( tịt bò); 41 C/12h( sữa) Ly tâm 6000 vòng/10 phút Thu cặn Rửa PSB ly tâm lần Thu cặn Phá vỡ tế bào thiết bị siêu âm siêu tốc Sandwich-Elisa Các thông số tối ưu phản ứng Elisa Kháng thể đa dòng Kháng thể đơn phủ đĩa dịng A10.16.I C3.26.IV 12,5 µg/ml 1,25 µg/m Tác nhân block đĩa Sữa tách bơ 5% Conjugate Pha loãng 1/1000 Ưu nhược điểm Elisa sandwich + Thời gian tiến hành thí nghiệm lâu + Chỉ sử dụng phát kháng nguyên kích thước phân tử lớn + Vẫn cịn tượng dương tính giả 01 Ưu điểm + Mẫu không cần phải tinh trước phân tích + Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên kháng nguyên/ chất phân tích bắt phát đặc hiệu + Thích hợp cho mẫu phức tạp + Linh hoạt độ nhạy cao Nhược điểm 02 1.NGUYÊN TẮC iệt độ ủ nh ụ n g d s t độ nhiệ erase polym đ ợc ủ t A iế N h D t ần Bs t ân t ố c L AM P , nh ả n ứng h v p u g ê n i độ ục ti s au: Để k h i gen m đầu nh Kh n a b g n a C tro xảy r í F2 c ; n ứng 60-65° ục tiêu vị tr ớc phả ge n m N a b D ứ A c h c h đổi, c i A DN o mạc không s ợi đ ô ung đầu ẽ bổ s s n ồi FIP; a b F ới ới từ m n liệu ình tự m r ê t y N u a D AD N m g ứ A N ợp s ợ i ài s ợ i i FIP ch h d ô g u o n x é ổ i k Sự t c 1: m ồi FIP; éo dài e t hự c + Bư p từ m đượ c k m e r as ợ h ly v o g p c n A F D N tổ c 2: D N su ng v g s ợi A + Bư i phò n i F3 bổ iả o g g n n ồi i F3 ; ẫn đ ế c 3: m ì đầu v mồ s e d + Bư ón g V olyme khuôn i p ợ A s N giải ph từ D c h ợ v n y đ ơn i nà ình th khu b ởi m nh c ấ u đ ợc h ình mồi FIP i A DN h ô từ n đ i ê p ợ n ợ F1 c 4: s h F1c + B ướ t n AD N g n đ u i s ợ bổ c 5: s trình tự + B ướ chứa ó c y sợi nà 5’ củ a n g; trúc vò Bước 6: sợ i ADN đư ợc tạo từ bước sợi v làm k mồi B3 hn cho có mồi BIP tổ c n ă n n g h ợp g F3 sợi ADN tổng h mồi BIP ợp sợi m ới giả + Bước i phóng : sợi đơi ADN đượ c hình th bước 5; ành từ m ồi B3 sợi tổng hợp + Bước từ : sợi ADN tổn g hợp từ thành cấ mồi BIP v u trúc vò sợi ng đầ a mồi FIP u b hình ổ sung củ a cặp tr ình tự vớ i => Để k hởi đầu c ho chu k ì phản ứn vịng v g LAMP, ị trí F2c đ FIP bắt c ể tiến hà ặp bổ su n ng với AD h tổng hợ BIP bổ N đầu p m ch sung vào b ổ s u ng thay đầu củ th ế a M m ặ t khác, ạch ADN hợp ADN đầu vòng tương tự Kết xảy c phản trình nhiều trìn ứng hỗ tổng h tự ADN n hợp cá mục tiêu c sợ i đôi ADN với kích th chứa ước khác 1.QUY TRÌNH THỰC HIỆN Thành phần phản ứng LAMP sau: đệm(10X): 2,5 μl, dNTP(10mM): 2,5 μl, mồi BIP(10pmol/μl): 0,8 μl, mồi FIP(10pmol/μl): 0,8μl, Bst DNA polymerase(5u/μl): 0,2 μl, DNAtemplate(6μg/ml): μl, H2O: 17,2 μl Chu trình nhiệtnhưsau: 94oC phút; 63oC 60 phút, 80oC 10 phút Trình tự vị trí cặp mồi FIP/BIP VT2BIP: 5’TGCTCTGGATGCATCTCTGGTCATATCTG GTTTCATCATATCTGGCG-3’ VT2FIP: 5’GCGTTTTGTCACTGTCACAGCAGATAGCC TGACGAAAT TCTCTCTGT-3’ Click icon to add picture PHẢN ỨNG LAMP O Tách chiết DNA tổng số Cùng với vi khuẩn E coliO157:H7, chúng em sử dụng vi khuẩn E coli ATCC làm đối chứng âm DNA tổng số hai chủng tách theo phương pháp Sambrook Russel Sau đó, DNA tổng số điện di gel agarose 1% Trước tiến hành phản ứng, DNA mẫu biến tính 94oC thời gian phút, sau đặt đá phút bổ sung thêm enzyme Bst polymerase Phản ứng tiếp tục 63oC thời gian từ 30 giây đến Kết cho thấy phản ứng LAMP cho kết dương tính với vi khuẩn E coli O157:H7, âm tính với vi khuẩn E coli ATCC Phát sản phẩm LAMP O n di AMP điệ L g n ứ n phả ản phẩm s trực n iệ h t phá thêm ể g đ n t ú ấ h h c n di, n giản n điệ ự t Cách V g n Tư i tia U % d i e o s agaros ng, sau tính ứ gel n ả h ửp g ống âm th n ữ g h n n ố n g , cò r vào át quan h tiếp EtB p ẽ s mồi) g tính DNA u dươn ẫ v u m ẫ g m n Nhữ DNA ( n h k é m độ sáng  Một cách p hát sả n phẩm LA MP b ằn g m Green I P thường hản ứng sa sử dụng SY u diễn BR , ch ú SYBR Gre ng ta bổ su en I Nhữn ng thêm g mẫu % dương tính âm tí cho màu nh cho xanh, màu vàng mẫu chanh O phản ứng LAMP hồn tồn xảy sử dụng cặp mồi BIP/FIP ứng LAMP hồn tồn xảy sử Ophản Phương pháp cómột thờicặp gian tiến hành phân tích kết nhanh O dụng duynày mồi BIP/FIP xác, kỹ thuật, hóa chất thiết bị đơn giản, pháp có thời gian tiến hành tíchphát kết OcóPhương vậy, thể thấy đâynày hướngphân tạo kít O nhanh đótốt kỹ thuật, hóa Nam nhanhquả điềuvà kiện làmxác, việctrong chưakhi Việt chất thiết bị đơn giản, vậy, thấy hướng tạo kít phát nhanh Phương đơn giản nhanh, phẩm phản ứng điềupháp kiệnnày làmrất việc chưa tốt nhưsản Việt Nam RT-LAMP nay.có thể xác định sau 60 phút phản ứng điều kiện nhiệt độ 61độC O Phương pháp đơn giản nhanh, sản phẩm phản ứng RT-LAMP xác định sau 60 phút phản ứng điều kiện nhiệt độ 61oC Kỹ thuật Multiplex-PCR phát chủng vi khuẩn STEC O Quy trình chung: 25g mẫu Tăng sinh Tách chiết DNA PCR Điện di Kết NGUYÊN TẮC PCR B1: giai đoạn biến tính nhiệt độ thường sử dụng 94-95°C Phản ứng PCR thực sở phản ứng sinh tổng hợp DNA ; phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp B2: giai đoạn lai ,nhiệt độ dao động B3: giai đoạn kéo dài thường khoảng 40-70°C 72°C - Mỗi chu kỳ gồm bước  Mỗi chu kỳ gồm bước lặp lại nhiều lần ; sau lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng DNA lần trước  Tùy theo lượng mẫu DNA lúc bắt đầu độ nhạy mong muốn mà số chu kỳ 20-30 chu kỳ Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu: Tên gen Trình tự oligonucleotide Kích thước khuếch đại( bp) stx1 stx1F: 5’- GAG CGA AAT TTA TAT GTG- 3’ 520 stx1R: 5’- TTG ATG ATG ATT CAG TAT- 3’ stx2 Stx2F: 5’ CCA TGA CAA CGG ACA GCA GTT-3’ stx2R: 5’ CCT GTC AAC TGA GCA CTT TGC-3’ Mẫu sử dụng: Thịt heo, thịt bò, thịt gà, sữa 780 2.PHƯƠNG PHÁP 2.2 Xử lý dịch vi khuẩn ly tríc Dịch vi k h DNA huẩn tron g eppendorf vòng/phú t tr đ  Rửa lại ong phút; loại bỏ pưhầợnc ly tâm 12000 bằn nước  Ly tâm g 0,5ml đệmTE; với tốc đ ộ trê tủa n để loại chuyền p bỏ phần n hù lại vớ ước,phần phút 10 o i ,5 m l kết T C E, đun cá ch thủy  Ly tâm 000 DNA tron vòng/phút, dich n ổi s g phả dụng n ứng PC m khuôn R  l o túi 225m v m ê h th in s vô trùng with 2.1 Tăng ya Broth o túi nilon o S v e o n h c to u p ẫ 0– 24 y °C trong1 Cân 25g m TSB ( Modified Tr ,5 ủ gm ng 30s -> môi trườn g tro n đ ), e in ml để ly Novobioc endoft1,5 p p e g n Ố PCR multiplex h khuẩ n v t n ậ a u c th h ỹ ịc k d ml tích Chuyển cho phân g n ù d A trích DN Thànhphần phản ứng PCR O Chương trình phản ứng PCR Được tiến hành theo bướ c sau: Tất thí nghiệm khuếch đại phản ứng PCR thực với dung tích phản ứng 50µl ống eppendorf 0,2ml, thành phần sau:25µl dung dịch PCR Master Mix,2ml mồi với nồng độ 0,5µM, 5µl khn DNA, thêm nước cất để đủ 50,0µl    94ºC phút 30 chu kỳ, chu kỳgồm: biến tính 94oC phút, bắt cặp 54ºCtrong1 phút, kéo dài 72oC phút giữ nhiệt độ 72ºC 10p đoạn DNA chưa tổng hợp hoàn chỉnh tiếp tục tổng hợp ; sau giữ ổn định 4ºC Phân tích sản phẩm 5µl sản phẩmkhuếch đại trộn với 2,5l đệm tải mẫu Nạp vào giếng gel agarose 2% có chất nhuộm DNA10,000X Điện di 130V, 250mAtrong 25 phút Quan sát ghi nhận kết KẾT LUẬN STEC chủng Escherichia coli có chứa thể thực khuẩn phân giải mang gen mã hóa sinh độc tố shiga Chúng em thực phương pháp nhanh để phát có mặt gen mã hóa stx PCR ; LAMP phát độc tố qua phương pháp ELISA Que thử, qua kết nhanh với độ đặc hiệu cao THANK YOU Any questionn? ...Nội dung 01 02 Tổng quan STEC Phương pháp phát nhanh STEC 03 Kết luận Phần 1: Tổng quan STEC   STEC bốn nhóm E coli gây bệnh truyền qua thực phẩm người Gây nhiễm trùng nguy hiểm... hành phân tích kết nhanh O dụng duynày mồi BIP/FIP xác, kỹ thuật, hóa chất thiết bị đơn giản, pháp có thời gian tiến hành tíchphát kết OcóPhương vậy, thể thấy đâynày hướngphân tạo kít O nhanh. .. di 130V, 250mAtrong 25 phút Quan sát ghi nhận kết KẾT LUẬN STEC chủng Escherichia coli có chứa thể thực khuẩn phân giải mang gen mã hóa sinh độc tố shiga Chúng em thực phương pháp nhanh để phát