Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài phát hiện norovirus

PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ RAU QUẢ GVHD: TS LÊ QUANG HỊA Nhóm 2: Dương Thị Hạnh – 20161352 Mai Khánh Huyền – 20161892 NỘI DUNG CHÍNH Giới thiệu Norovirus Tách chiết RNA Các phương pháp phát So sánh ưu nhược điểm phương pháp Giới thiệu Norovirus + Novorius loại virút thuộc họ Caliciviridae,rất nhỏ khơng có màng bao quanh với đường kính 27-35 nm + Các norovirus có tính di truyền đa dạng kháng nguyên,được chia làm 40 dạng.Bộ gen RNA sợi đơn chia thành vùng đọc mở : • • • Vùng đọc mở thứ ORF1 (5kb) mã hóa phân tử polyprotein ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1 Vỏ ORF3 mã hóa pro VP2 nhỏ chưa biết chức + Genogroup I (G1) G2 gen phổ biến gây bệnh người Đối tượng thực phẩm có nguy nhiễm Norovirus  Norovirus nguyên nhân phổ biến gây ca viêm dày cấp hầu hết nhóm tuổi  Quá trình ủ bệnh thường xảy từ 24-48h triệu chứng kéo dài từ 12-60h Tách chiết RNA Giải phóng virus Tách chiết RNA Lấy 25±0,3g mẫu đại diện, cắt nhỏ cho vào túi lọc màng 400ml Tách chiết RNA Thêm 40±1ml dd đệm TGBE (thêm pectinase mẫu mềm) 2.1 Giải phóng virus o Ủ, t phịng, lắc liên lục, (20±1) phút, pH = 9,5±0,1 Đối với rau quả: o Gạn dịch rửa giải vào ống ly tâm, ly tâm 30±5 phút, 5±3 C Gạn phần phía vào ống, chỉnh pH = 7,0±0,5 Khoảng 3h o Thêm dung dịch PEG/NaCl, lắc để đồng hóa (60±5)s, ủ lắc liên tục (60±5) phút, (5±3) C o Ly tâm (30±5) phút (5±3) C, sau bỏ phần dịch phía Hịa lại hạt mẫu 500±10µl PBS Chuyển huyền phù vào ống ly tâm loại hẹp chịu cloroform, thêm (500 ± 10) µl hỗn hợp cloroform/butanol, vortex, ủ phút (đối với mềm làm tiếp bước bước sau) Ly tâm (15 ± 1) (5 ± 3) °C Chuyển cẩn thận pha lỏng vào ống giữ lại để tách chiết ARN Tách chiết RNA 2.1 Giải phóng virus Dùng dao vơ trùng tách vỏ, 10 Đối với nhuyễn thể hai mảnh vỏ (BMS): Cắt 2,0±0,2 g tuyến tiêu hóa, sau đem đồng hóa Nhuyễn thể hai mảnh vỏ dùng để phân tích phải sống đơng lạnh khơng bị hư hỏng Phải loại bỏ bùn bám vỏ Không ngâm lại vào nước o Thêm (2,0 ± 0,2) ml dung dịch protease K, Ủ (37±1) C, đồng thời lắc (60 ± 5) phút Khoảng 2h Ủ lần (60 ± 2,0) °C (15 ± 1) phút Ly tâm (5,0 ± 0,5) phút nhiệt độ phịng Gạn phần phía trên, giữ lại để tách chiết RNA Các phương pháp tách chiết TÁCH CHIẾT RNA SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS ®  Thuốc thử: Dung dịch đệm lysin BioMerieux Nuclisens ® ® Thuốc thử chiết từ tính BioMerieux Nuclisens  (gồm dung dịch silica từ tính, dung dịch đệm rửa 1, 2, dung dịch đệm rửa giải) Thiết bị: Quá trình tách chiết diễn khoảng 40 – Thiết bị miniMAG hoặc easyMAG BioMerieux Nuclisens Giá từ tính BioMerieux Nuclisens 60 phút ® ® Máy ủ lắc nhiệt Ống có nắp vặn, dung tích 1,5 ml, thích hợp để sử dụng với thiết bị NucliSens ® Các phương pháp tách chiết TÁCH CHIẾT RNA SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS ®  Chuyển dịch vào ống nắm vặn 1,5 ml Rửa (30 ± 2) s Sử dụng hệ thống miniMAG/easyMAG Để silica lắng xuống ® Cho (2 ± 0,1) ml dd đệm phân giải NucliSens + (500 ± 10) µl mẫu (BMS) Tách ống khỏi khối từ Loại bỏ phần phía (lắc nhẹ) Thêm (400 ± 10) µl dd đệm rửa Hòa lại hạt nhỏ, rửa (30 ± 2) s o Ủ (10 ± 1) phút, t phòng Để silica lắng xuống Thêm (50 ± 2) µl dd silica từ tính Loại bỏ phần phía Tách ống khỏi khối từ (lắc nhẹ) o Thêm (500 ± 10) µl dd đệm rửa Hòa lại hạt nhỏ, rửa (30 ± 2) s Ủ (10 ± 1) phút, t phòng Để silica lắng xuống Loại bỏ phần phía Tách ống khỏi khối từ Ly tâm (120 ± 10) s 500 x g, sau loại bỏ lớp huyền phù phía Thêm (500 ± 10) µl dd đệm rửa Hịa lại hạt nhỏ, rửa (15 ± 1) s Thêm (100 ± 2) µl dd đệm rửa giải chuyển vào máy ủ lắc nhiệt (5,0 ± 0,5) (60 ± 1) °C Thêm (400 ± 10) µl dd đệm rửa hòa lại hạt nhỏ cách nhỏ giọt lắc Đặt ống vào giá từ tính để silica lắng xuống, sau chuyển chất rửa giải vào ống 3.1 Real-time RT-PCR 3.1 Real-time RT-PCR Kết quả: • Dựa vượt ngưỡng phát huỳnh quang Ct (Cycle threshold) • Cq (Cycle quantitive) tuyến tính với log[DNA] 3.1 Real-time RT-PCR  Cách tiến hành: 3.1 Real-time RT-PCR Đối với thành phần hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR bước sử dụng hệ thống intrivitrogen ARN ultrasense TM[1])  qRT-PCR bước 3.1 Real-time RT-PCR Bảng thông số chu trình Các phương pháp phát Norovirus 3.2 RT - LAMP Nguyên tắc: • • • • • • Kỹ thuật khuếch đại DNA dựa cấu trúc vòm Sử dụng 13 mồi thiết kế đặc biệt có chứa sở hỗn hợp cho nhóm gen I (GI) II (GII) tương ứng Dùng DNA plymeraza có khả chuyển vị mạch (đẩy mạch cản trở ra) o Chỉ ủ khoảng thời gian xác định (60-65 C) 10 Phản ứng khuếch đại lớn thời gian ngắn ( 10 -10 lần 15-60 phút) Phản ứng với thiết bị đơn giản, diễn nhanh chóng 3.2 RT - LAMP 3.2 RT - LAMP 3.2 RT - LAMP 3.2 RT - LAMP 3.2 RT - LAMP Mồi: 3.2 RT - LAMP Kết quả: Đo độ đục 650nm LA-320C (Teramecs) Đánh giá khả phản ứng chéo xét nghiệm RT-LAMP đặc hiệu genogroup genogroup I II 3.2 RT - LAMP Cách tiến hành: Xét nghiệm RT-LAMP thực 25 μl hỗn hợp phản ứng với khuếch đại RNA (Eiken Chemical, Tochigi, Nhật Bản) 12,5 μl hỗn hợp phản ứng 2X o Ủ hỗ hợp phản ứng, 62 C, 60 phút 1,0 μl hỗn hợp enzyme 2,5 μl RTmate (gen Nippon, Toyama, Nhật Bản) Làm nóng 80 C, phút máy đo độ đục thời gian thực pmol (mỗi) mồi F3 B3, 25 pmol (mỗi) đoạn mồi FIP1, FIP2, BIP1 BIP2 cho GI  20 pmol (mỗi) đoạn mồi FIP2, FIP3, BIP2, BIP3 BIP4 cho GII, 20 đoạn mồi LF1, LF2 LF3 cho GI  2 μl chiết xuất RNA Loopamp 650 nm (LA-320C; Teramecs, Kyoto, Nhật Bản) So sánh ưu nhược điểm phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Real time RT – PCR RT - LAMP • • • • • • • Đồng thời khuếch đại phát q trình khuếch đại theo cấp số nhân • • • • • Ngưỡng phát hiện: 3-5 sao/ống • • Thời gian: khoảng 1h không kể thời gian tách chiết RNA Ngưỡng phát hiện: 10 -10 sao/ống • • • Thiết bị đắt tiền • • Thiết kế mồi phức tạp Giám sát thời gian thực khuếch đại xảy Định lượng, hữu ích để theo dõi tải lượng virus Tăng độ nhạy hóa huỳnh quang Phân tích thơng lượng cao hoạt động dựa phần mềm Thời gian: khoảng 3h không kể thời gian tách chiết RNA Yêu cầu cao đầu dò huỳnh quang Real time RT – PCR two – step nhiễm chéo chuyển ống thí nghiệm Khuếch đại gen dựa trường đẳng nhiệt mà khơng cần lặp lại vịng nhiệt Sự khuếch đại thực với bể ổn nhiệt / khối sưởi Thời gian thực định lượng Hiệu suất khuếch đại độ nhạy cao Theo dõi mắt thường thông qua độ đục thay đổi màu sắc thuốc nhuộm xen kẽ huỳnh quang Hạn chế có sẵn thuốc thử thiết bị số nước Danh mục tham khảo TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 10783-1:2015, ISO/TS 15216-1:2013 https://jcm.asm.org/content/44/4/1376.full ... giải vào ống 3 Các phương pháp phát Norovirus 3.1 Real time RT-PCR  Nguyên tắc:  Dựa hoạt tính enzyme Taq  Sử dụng mẫu dị có đầu phát huỳnh quang cho phát NoV GI phát NoV GII nhờ khuếch đại sản... Đồng thời khuếch đại phát trình khuếch đại theo cấp số nhân • • • • • Ngưỡng phát hiện: 3-5 sao/ống • • Thời gian: khoảng 1h không kể thời gian tách chiết RNA Ngưỡng phát hiện: 10 -10 sao/ống... quang phát theo thời gian chu kỳ phản ứng PCR 3.1 Real-time RT-PCR Tổng hợp cDNA (Do vật liệu di truyền Norovirus RNA) 3.1 Real-time RT-PCR 3.1 Real-time RT-PCR Kết quả: • Dựa vượt ngưỡng phát