Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài: Phát hiện staphylococal enterotoxins trong thịt và sữa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Viện CNSH CNTP Phát nhanh Độc tố tụ cầu vàng thịt sữa GVHD: TS Lê Quang Hịa Nhóm SVTH: Nguyễn Thùy Linh - 20162463 Dương Bích Nguyên - 20162981 Dương Đức Duy - 20160751 TỔNG QUAN I Giới thiệu chung S aureus II Sắc ký miễn dịch III Phương pháp ELISA SANDWICH IV Chất ức chế miễn dịch hóa phát quang dựa hạt nano vàng I Giới thiệu chung Vi khuẩn starphylococus aureus • VK hình cầu, khơng di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, khơng di động • Thành tế bào kháng với lysozyme nhạy với lysotaphin, chất phá hủy cầu nối pentaglycin tụ cầu 2 Độc tố • • Tụ cầu vàng sản sinh 12 độc tố, có độc tố ruột chia làm 20 loại (từ SEA đến SEE, từ SEG đến SER SEU) Các độc tố có chất chuỗi protein đơn có KLPT thấp (khoảng 22 - 29 kDa), chuỗi có vị trí kháng nguyên chuyên biệt Các độc tố dễ tan nước dung dịch muối Đặc biệt, SE mô tả hầu hết có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt không bị protease thông thường pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, … thủy phân chúng giữ nguyên cấu trúc đường tiêu hóa người • • • • ĐKT, tụ cầu vàng phát triển đạt số lượng khoảng 106 cfu/g tạo độc tố o 0 Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh độc tố ruột tụ cầu 10 C nhiệt độ tối đa 48 C, khoảng tối ưu từ 40 đến 45 C Nồng độ muối tối đa 12%, từ 12% trở lên sản xuất độc tố bị ức chế ĐK thích hợp cho trình hình thành độc tố pH trung tính 3 Triệu chứng a Nhiễm trùng da Nhọt b Viêm khớp nhiễm khuẩn • • • Sưng khớp Đau nhức khớp bị ảnh hưởng Sốt Chốc Viêm mô tế bào Hội chứng bỏng da c Ngộ độc thực phẩm - Diễn tiến nhanh, thường vòng 2-6h sau ăn thực phẩm chứa SE Triệu chứng: buồn nôn nôn nhiều, tiêu chảy dẫn đến nước, huyết áp thấp, dẫn đến nhiễm trùng huyết d Nhiễm khuẩn huyết: Biểu thường đột ngột với: - Sốt cao - Buồn nơn ói mửa - Phát ban lòng bàn tay lòng bàn chân, tương tự bị cháy nắng - Sự lú lẫn - Đau - Bệnh tiêu chảy - Đau bụng - Viêm khớp tự hoại KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Sắc ký miễn dịch cạnh tranh Cấu trúc hệ thống sắc ký miễn dịch cạnh tranh Màng nitrocellulose Bao gồm • Điểm tra mẫu • Cộng hợp: Kháng nguyên gắn với hạt màu (hạt nano vàng nanocacbon) • Vạch thử nghiệm: Cố định kháng thể có khả bắt cặp với kháng nguyên cần phát Vạch kiểm Tra mẫu Cộng hợp • Vạch kiểm chứng: Kháng thể kháng kháng thể KN-Hạt màu Vạch thử nghiệm chứng Phức hợp Kháng nguyên nanocacbon CẤU TRÚC QUE THỬ PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ TỤ CẦU SE (A-E) Y Y Y Y Y Y Kháng thể IgY kháng BSA Kháng thể IgY có khả kháng loại độc tố ruột tụ cầu (A,B,C1,D,E) Nguyên tắc - Tại vị trí vạch thử nghiệm kháng thể IgY có khả bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích cố định Nếu độc tố khơng có mặt mẫu phân tích dung dịch chuyển động lên que thử phía vùng chứa kháng thể cố định (vạch thử nghiệm), kháng nguyên cộng hợp tương tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên cộng hợp có màu vị trí vạch thử nghiệm (Âm tính) - Ngược lại, mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu chúng cạnh tranh với kháng nguyên cộng hợp việc bị giữ lại vị trí vạch thử nghiệm => Không xuất vạch màu vị trí vạch thử nghiệm (Dương tính) Các bước tiến hành THỊT SỮA Nghiền mẫu Pha loãng sữa (Nồng độ thích hợp theo HDSD) Hịa tan mẫu vào nước vơ trùng 5p Nhúng que thử vào mẫu Hút mẫu lên que thử Đọc kết Đọc kết Độ nhạy   Thời gian tiến hành thí nghiệm nhanh Sử dụng với kháng ngun có kích thước nhỏ với độ nhạy cao  Với SEA, SEB SED phân tích mắt thường, độ nhạy phát que thử khoảng 30-100 ng/ml  Với SEC1, SEE độ nhạy phát que thử khoảng 10-30 ng/ml Ưu điểm Phương pháp ELISA sandwich Hiện thị trường có nhiều kit thử nhanh áp dụng ELISA RIDASCREEN® SET A, B, C, D, E (Art No.: R4101) xét nghiệm miễn dịch enzyme để xác định loại độc tố tụ cầu vàng A, B, C, D E thức ăn lỏng rắn môi trường nuôi cấy vi khuẩn PHƯƠNG PHÁP ELISA Sandwich Nguyên tắc Cơ sở xét nghiệm phản ứng kháng nguyên-kháng thể Các giếng A - E H dải microtiter phủ kháng thể đặc hiệu chống lại loại độc tố tụ cầu A, B, C, D E, giếng F G đóng vai trị kiểm sốt phủ kháng thể động vật không tiêm chủng sau đây: Thành phần Kit Tiến hành Chuẩn bị mẫu Các   mẫu phải bảo quản tiến hành xử lý Các chủng loài S aureus có khả hình thành độc tố phải làm giàu trước Tăng sinh Brain-Heart-Infusion (BHI) để đảm bảo hình thành tối ưu enterotoxin Chuẩn bị kit thử Tiến hành kiểm tra Kết luận Chuẩn bị pha loãng dung dịch đệm 10 lần nhiệt độ phòng Theo dẫn Kit Chuẩn bị mẫu Thịt Sữa Ly tâm 10 - 25 ml sữa 10 phút / 3500 g / 10 ° C Đồng hóa 10 - 25 g mẫu với 1,5 ml dung dịch đệm PBS (pH 7,4) g mẫu Loại bỏ lớp kem bề mặt Lắc 15 phút   Hút 100 cho giếng Ly tâm: 10 phút / 3500 g / 10 ° C Nếu cần, loại bỏ lớp mỡ   Hút 100 cho giếng Ti ế n h àn h k i ể m t Xếp dải giếng vào khay đựng giếng tương ứng số mẫu Thêm 100 µl mẫu vào giếng A đến G, 100 µl mẫu dương tính vào giếng H Lắc nhẹ, đậy nắp ủ 35-37oC Đổ dịch từ giếng, đập lần mặt khay đựng giếng vào khăn lọc Rửa giếng 300 µl đệm rửa đổ, lặp lại bước rửa Đọc kết vòng 30 lần vài phút sau thêm stop solution Thêm 100 µl conjugate vào giếng Lắc nhẹ, đậy nắp ủ 35-37oC Thêm 100 µl stop solution cho giếng Trộn nhẹ nhàng cách lắc đĩa tay đo độ hấp thụ 450/630 ± 10nm Đổ dịch từ giếng, đập lần mặt khay đựng giếng vào khăn lọc Rửa giếng 300 µl đệm rửa đổ, lặp lại bước rửa lần Thêm 100 µl conjugate vào giếng Lắc nhẹ, đậy nắp ủ 0,5 35-37oC Thêm 100 µl dung dịch Substrate/Chromogen giếng Lắc nhẹ, đậy nắp ủ 0,25 35-37oC Đổ dịch từ giếng, đập lần mặt khay đựng giếng vào khăn lọc Rửa giếng 300 µl đệm rửa đổ, lặp lại bước rửa lần Kết RIDA®SOFT Win (Art No Z9999) phần mềm đặc biệt phát triển cho RIDASCREEN® để xét nghiệm miễn dịch enzyme có sẵn từ R-Biopharm Kết Kiểm soát chất lượng kiểm tra (phạm vi hợp lệ cho kiểm soát) Giá trị độ hấp thụ mẫu dương tính phải lớn 1.0 Giá trị độ hấp thụ trung bình mẫu âm tính phải nhỏ hơn 0,2 đơn vị Nếu tiêu chí chưa đáp ứng, cần kiểm tra bước sau sửa chữa trước lặp lại kiểm tra: - Kiểm tra hạn sử dụng Kit - Đảm bảo đủ thời gian cho phép dung dịch dụng cụ đạt đến nhiệt độ phòng 20 - 25 ° C - Một đầu pipet phải sử dụng cho mẫu điều khiển để tránh chéo ô nhiễm - Kiểm tra đệm rửa xem có bị nhiễm bẩn khơng (có thể sử dụng nước vô trùng cho chuẩn bị) - Rửa giếng không đầy đủ / bước rửa theo khuyến nghị Kết Xác định giá trị ngưỡng Giá trị độ hấp thụ trung bình giá trị kiêmr sốt âm giếng F G xác định riêng cho mẫu Thêm 0,15 vào giá trị trung 0.159 bình giá trị kiểm sốt âm để lấy giá trị ngưỡng Example: Negative control (well F) = 0.008 Negative control (well G) = 0.010 Mean value = 0.009 Threshold value = 0.009 + 0.15 =0.159 Một mẫu coi dương tính thử nghiệm hợp lệ Và độ hấp thụ đo 450/630 ± 10nm giếng thích hợp cao giá trị ngưỡng Một mẫu coi âm tính thử nghiệm hợp lệ Và độ hấp thụ đo 450/630 ± 10nm giếng thích hợp thấp giá trị ngưỡng Ưu điểm      Thời gian tiến hành thí nghiệm lâu Chỉ sử dụng phát kháng nguyên kích thước phân tử lớn Vẫn cịn tượng dương tính giả Mẫu khơng cần phải tinh trước phân tích Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên kháng nguyên/ chất phân tích bắt phát đặc hiệu   Thích hợp cho mẫu phức tạp Linh hoạt độ nhạy cao Nhược điểm Danh mục tham khảo Tạp chí cơng nghệ sinh học 15(3): 461-469,2017 Tạp chí cơng nghệ sinh học 14(1): 23-28,2018 https://azmax.co.jp/wp-content/uploads/2015/11/R4101_SET_A-E_-13-11-25.pdf https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4963824/ ... dụng phát kháng nguyên kích thước phân tử lớn Vẫn cịn tượng dương tính giả Mẫu khơng cần phải tinh trước phân tích Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên kháng nguyên/ chất phân tích bắt phát. .. thí nghiệm nhanh Sử dụng với kháng nguyên có kích thước nhỏ với độ nhạy cao  Với SEA, SEB SED phân tích mắt thường, độ nhạy phát que thử khoảng 30-100 ng/ml  Với SEC1, SEE độ nhạy phát que thử... thử nghiệm (Dương tính) Các bước tiến hành THỊT SỮA Nghiền mẫu Pha lỗng sữa (Nồng độ thích hợp theo HDSD) Hịa tan mẫu vào nước vô trùng 5p Nhúng que thử vào mẫu Hút mẫu lên que thử Đọc kết Đọc kết