Báo cáo Phân tích nhanh Đề tài CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH CHẤT tạo nạc TRONG THỊT HEO

ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH CHẤT TẠO NẠC TRONG THỊT LỢN GVHD: TS.Lê Quang Hòa SVTH: Nguyễn Thùy Linh - 20152214 Nguyễn Thủy Tiên - 20153750 Lê Thị Thu - 20153640 I Tổng quan chất tạo nạc thịt lợn NỘI DUNG II Phương pháp phát nhóm β-Agonist sử dụng Kit thử ELISA III Phương pháp phát đồng thời ractopamine, clenbuterol salbutamol cảm biến sinh học điện hóa sử dụng hạt nano bạc - palladium IV Phương pháp phát Clenbuterol hydrochloride (CLB) sử dụng cảm biến sinh học dựa tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) V Kết luận I Tổng quan chất tạo nạc Khái niệm  Chất tạo nạc hay chất tăng trọng hợp chất hóa học thuộc họ β- agonist xếp vào loại chất độc cấm sử dụng chăn ni tồn giới Gồm chất có tác dụng kích thích tim, dùng để điều trị sốc tim, suy tim cấp tính Nhóm β1-agonist VD: Dobutamine, Isoproterenol, Xamoterol, Epinephrine… β-agonist Gồm chất làm giãn cơ, dùng để điều trị hen suyễn, bệnh phổi mãn tính Nhóm β2-agonist VD: Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine, Salmeterol, Terbutaline, Clenbuterol, Isoetarine, pirbuterol,procaterol, ritodrine, epinephrine… Khái niệm Sabutamol Clenbuterol Ractopamine CTPT: C13H21NO3 CTPT: C12H18N2Cl2 CTPT: C18H23NO3  Ba chất đứng đầu danh mục 18 chất kháng sinh, hóa chất bị cấm sử dụng chăn nuôi Bộ NN&PTNT ban hành năm 2002  Hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa, có khả tồn dư lâu thể động vật chế biến Cơ chế tạo nạc Gia tăng lượng protein giảm lượng mỡ đến 40% ( Courtheyn et al.,2002) Ảnh hưởng β-agonist đến q trình phân phối dưỡng chất đến mơ mô mỡ vật nuôi  Tác hại nhóm chất tạo nạc  Ngộ độc cấp tính: Gây rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, tăng huyết áp, nguy sẩy thai,…  Ngộ độc mãn tính: Gây nhiễm độc gan, dẫn đến rối loạn hệ thống hormon thể,ung thư… Gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hồn, chí gây chết người Tình hình sử dụng chất tạo nạc thịt lợn  Theo số liệu Bộ Cơng an, năm 2015 có 20 doanh nghiệp tham gia nhập 9.140kg Salbutamol VN  Ngày 3/1/2019, Chi cục Chăn nuôi, thú y thủy sản tỉnh Bình Dương phối hợp với quan chức tiến hành tiêu hủy lô hàng gần 1,5 thịt heo có chứa chất cấm salbutamol  Theo Bộ luật Hình 2015, tổ chức, cá nhân sử dụng chất cấm chăn nuôi phải lĩnh mức án 20 năm tù, bị phạt tiền tới tỉ đồng bị cấm sản xuất, kinh doanh Dấu hiệu nhận biết thịt heo tạo nạc  Phần lớn dựa cảm quan cảm tính, khơng xác  Xem lớp mỡ bên da miếng thịt thường mỏng lỏng lẻo  Màu sắc: Thịt lợn chứa chất tạo nạc thường có màu đỏ tười khác thường, sáng bóng  Thái miếng thịt dày 2-3 ngón tay, thấy thịt mềm, không đứng thẳng bàn => Có khả thịt bị nhiễm chất tạo nạc  Quan sát xem chỗ liên kết phần nạc mỡ, thấy tách rời rõ rệt, đồng thời có nước dịch màu vàng rỉ => Có khả thịt siêu nạc Thịt lợn có chất cấm Thịt lợn bình thường II Phương pháp phát nhóm βAgonist sử dụng Kit thử ELISA Kết Hình a: RAC Đường cong 1: Các điện cực khơng có rGO: có dịng điện thấp PBS Đường cong 2: rGO gắn điện cực làm việc: dòng điện tăng đáng kể  rGO làm tăng đáng kể độ dẫn điện cực Đường cong 4: Kháng nguyên RAC BSA gắn vào điện cực làm việc, gây suy giảm dòng điện nền, cản trở chuyển điện tử điện cực dung dịch Đường cong 5: Khi cảm biến sinh học phản ứng với kháng thể chống RAC / AgPd: Theo thay đổi hiệu điện thế, xuất đỉnh cường độ dòng điện Bộ cảm biến sinh học cho CLB SAL tương tự cảm biến sinh học cho RAC 24 Kết Xây dựng đường chuẩn với nồng độ RAC (a), SAL (b), CLB (c) mẫu biết trước: Khoảng tuyến tính cường độ dịng điện nồng độ: từ 0.01 ng/ml đến 100 ng/ml Trong khoảng tuyến tính, cường độ dòng điện nghịch biến với nồng độ chất chuẩn 25 Đánh giá phương pháp Ưu điểm: Nhược điểm: ⊳ ⊳ ⊳ Độ nhạy cao nhờ tín hiệu điện đo cụ thể: Giới hạn thấp phát được: RAC 1.52 pg/ml, SAL 1.44 pg/ml, CLB 1.38 pg/ml ⊳ ⊳ Không phát chất tạo nạc khác Cần có thiết bị chuyển đổi tín hiệu máy tính xử lí kết Dễ thực hiện, chi phí thấp Phát loại chất tạo nạc hay gặp 26 IV Phát Clenbuterol hydrochloride (CLB) sử dụng cảm biến sinh học dựa tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) Khái niệm  Plasmon dao động tập thể điện tử tự chất rắn  Surface plasmon dao động điện tử tự bm KL kích thích ánh sáng  Surface plasmon resonance (SPR) - Cộng hưởng plasmon bề mặt xảy vectơ sóng ánh sáng tới vectơ sóng sóng plasmon bề mặt  Phân tử cố định bề mặt kim loại (ligand) cộng hợp với phân tử di động (analyte) => Sự thay đổi góc cộng hưởng  Khối lượng phân tử lớn, thay đổi lớn 28 Nguyên tắc phát CLB  KL phân tử CLB nhỏ => Không thể phát trực tiếp => Phương pháp phát cạnh tranh  Biochip: Một film vàng cố định bề mặt kính  Phân tử cố định : Clenbuterol–bovine serum albumin (CLB-BSA)  Phân tử di động: Hỗn hợp Clenbuterol antibody CLB mẫu PT  Nguyên tắc: • Sự cộng hợp ligand analyte làm thay đổi góc cộng hưởng, thể Giá trị đáp ứng (Response value - RV) • CLB cộng hợp cạnh tranh antibody với CLB-BSA • Nồng độ CLB mẫu tỉ lệ nghịch với RV 29 Quy trình tiến hành Chuẩn bị mẫu Tạo Biochip Tiến hành phát Xử lý KQ 30 Chuẩn bị mẫu 2g thịt lợn + 6ml HCl (0.1 mol/L) Lắc mẫu 10 Ly tâm 10 TR 3ml dịch + 2ml NaOH (0.1 mol/L) + 6ml Ethyl Acetate Lắc mẫu 10 Ly tâm 10 TR o Làm khô dịch N 50 C Thêm ml nước cất để hòa tan 31 Tạo Biochip film vàng cố định mặt kính Ngâm film khoảng 2h HH mmol/L HS(CH2)10COOH HS(CH2)6OH (1:9) ethanol Rửa PBS Thêm NHS (0.1 mol/L) + EDC (0.1 mol/L) (1:1,V/V) để kích hoạt biochip 15 minh Đầu dò sinh học (CLB-BSA 83mg/L) cố định bề mặt Biochip 30 Rửa PBS PBS: Phosphate Buffered Saline Thêm ethanolamine (pH 8.5, mol/L) để loại bỏ liên kết este cịn sót lại NHS: N-hydroxysuccinimide EDC: N-ethyl-N′- (dimethylaminopropyl) carbodiimide Eth: Ethanolamine Mercapto-undecanoic acid: HS(CH2)10COOH Mercapto-hexanoate: HS(CH2)6OH Rửa PBS từ 5-7 32 Kháng thể CLB hòa với PBS thu dd 20mg/L Tiến hành phát Trộn dd kháng thể với mẫu (hoặc CLB chuẩn) Sau min, cho hh lên bề mặt Biochip Phản ứng kháng nguyên – kháng thể xảy Detector ghi lại thay đổi góc cộng hưởng sau phản ứng, rửa bề mặt biochip SDS-HCl Rửa PBS Khi RV lại giá trị ban đầu, tiến hành phân tích mẫu SDS: Sodium dodecyl sulfate 33 Xử lý số liệu  Xây dựng đường chuẩn thể mqh Giá trị đáp ứng - Nồng độ CLB (µg/L)  Dựa vào đường chuẩn để xác định nồng độ CLB mẫu PT  LOD: μg/L 34 Đánh giá phương pháp Ưu điểm  Dựa vào khác khối lượng chất Nhược điểm  Chi phí thiết bị cao => Khơng cần ghi nhãn mẫu   Có khả PT số lượng mẫu lớn (50 lần) Dễ dàng tái sử dụng 35 V KẾT LUẬN  Chất tạo nạc hay chất tăng trọng hợp chất hóa học thuộc họ β- agonist xếp vào loại chất độc cấm sử dụng chăn ni tồn giới  Tác hại chủ yếu gây ngộ độc cấp tính  Phương pháp phát nhanh chất tạo nạc thịt heo bao gồm sử dụng Kit thử ELISA, cảm biến sinh học  Ngoài ra, người tiêu dùng nhận biết thịt lợn tạo nạc qua số đặc điểm cảm quan thông thường 36 Tài liệu tham khảo Wang, R., Zhang, W., Wang, P., & Su, X (2018) A paper-based competitive lateral flow immunoassay for multi β-agonist residues by using a single monoclonal antibody labelled with red fluorescent nanoparticles Microchimica Acta, 185(3) doi:10.1007/s00604-018-2730-9 Li, Y., Qi, P., Ma, X., & Zhong, J (2014) Quick detection technique for clenbuterol hydrochloride by using surface plasmon resonance biosensor European Food Research and Technology, 239(2), 195–201 doi:10.1007/s00217-014-2201-4 A silver–palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor for simultaneous detection of ractopamine, clenbutero l and salbutamol - Huan Wang, Yong Zhang, He Li, Bin Du, Hongmin Ma, Dan Wu, Qin Wei https://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/BIO_/100903.20110325.pdf https://www.youtube.com/watch?v=sU4YsCwtjfQ https://fas.tdtu.edu.vn/tin-tuc/2018/thuoc-tao-nac-trong-chan-nuoi-heo http://viendinhduong.vn/vi/tin-tuc/canh-giac-voi-chat-tao-nac-clenbuterol-trong-thit-lon.html 37 Thanks! Any questions? 38 ... Chất tạo nạc hay chất tăng trọng hợp chất hóa học thuộc họ β- agonist xếp vào loại chất độc cấm sử dụng chăn ni tồn giới  Tác hại chủ yếu gây ngộ độc cấp tính  Phương pháp phát nhanh chất tạo nạc. .. palladium IV Phương pháp phát Clenbuterol hydrochloride (CLB) sử dụng cảm biến sinh học dựa tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) V Kết luận I Tổng quan chất tạo nạc Khái niệm  Chất tạo nạc hay chất. .. dịch màu vàng rỉ => Có khả thịt siêu nạc Thịt lợn có chất cấm Thịt lợn bình thường II Phương pháp phát nhóm βAgonist sử dụng Kit thử ELISA NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA PHƯƠNG PHÁP ELISA • Là PP xét nghiệm