I 2+ SO 2+ 2H2O = 2H + H2SO
4.8.2. Xác định aflatoxin
Aflatoxin được sinh ra bởi nấm mốc aspergilus flavus và aspergilus parasiticus. Aflatoxin có thể tím thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp như ngô, lạc, lúa mạch, lúa mì, hạt bông…Có 4 chất thuộc nhóm aflatoxin có thể tìm thấy trong thực phẩm, đó là Aflatoxin B1, B2, G1, G2. Aflatoxin B1 là chất độc nhất, gây ung thư gan cho người và súc vật. Giới hạn tối đa cho phép độc tố vi nấm aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung là 5µg/kg. Giới hạn tối đa cho phép hàm lượng tổng độc tố vi nấm aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thực phẩm nói chung là 15µg/kg.
Chúng là những chất dị vòng có khả năng phát huỳnh quang ddawcj trưng bởi nhân dihydrofuran hoặc tetrahydrofuran. Chúng phát huỳnh quang khi chiếu chùm tia cực tím (UV 366nm): B1, B2 chuyển thành màu xanh da trời; G1, G2 chuyển thành
màu xanh lá cây. Chúng là những chất không phân cực, khối lượng phân tử thấp, chịu được hóa chất và các tính chất lý học, sinh học.
Một số kỹ thuật xác định aflatoxin trong thực phẩm: − Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng
− Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV hoặc detector huỳnh quang hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ.
Điều quan trọng là chiết xuất làm sạch mẫu aflatoxin trong thực phẩm, có nhiều phương pháp chiết xuất làm sạch mẫu aflatoxin trong thực phẩm. Các phương pháp chiết xuất làm sạch đang được áp dụng:
− Chiết xuất aflatoxin trong thực phẩm bằng dung môi hữu cơ và làm sạch bằng cột nhồi thủy tinh silicagen hoặc florisil
− Chiết xuất aflatoxin trong thực phẩm bằng dung môi hữu cơ và làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE/ LC-Si hoặc cột chiết pha rắn LC- CN
− Chiết xuất aflatoxin trong thực phẩm bằng dung môi hữu cơ và làm sạch bằng cột sác ký ái lực miển dịch tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid
Sau đây giới thiệu phương pháp xác định aflatoxin bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch.
a. Nguyên tắc
Aflatoxxin trong mẫu được chiết xuất bằng methanol. Sau đó được làm sạch bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch và tạo dẫn xuất với với trifluro acetic acid (TFA) rồi xác định trên máy sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang.
Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho các loại ngũ cốc, sữa, các thực phẩm có dầu. Tài liệu trích dẫn: AOAC 994.08-1996; AOAC 986.16-2000.
b. Dụng cụ - Hóa chất - Thiết bị − Giấy lọc thô − Phễu lọc − Bình tam giác 250ml − Cốc có mỏ − Ống đong 100, 250ml − Bình lọc 1 lít, phin lọc 0,45µm − Phin lọc mẫu 0,45µm − Syringe 3ml. − Bình khí nitơ − Micro pipette 20 - 200 µl − Micro pipette 20 - 200 µl − Cột sắc ký ái lực
− Hệ thống chiết pha rắn SPE − Nước cất siêu sạch
− Metanol − Acetonitrile − NaCl
− Trifluro acetic acid (TFA) − n- hecxane
− Dung dịch chiết mẫu methanol : nước (70:30) − Dung dịch acetonitril : nước (10:90)
− Dung môi pha động acetonitril: nước (25:75), dung môi được lọc qua phin lọc 0.45µm, rung siêu âm đuổi khí.
− Dung dịch chuẩn gốc aflatoxin B1, B2, G1, G2 pha trong acetonitril : benzene (2:98)
− Hệ thống sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang có bước sóng kích thích 360nm và bước sóng phát xạ 440nm.
− Cột sắc ký lỏng Inertsil ODS – 3V 150 x 4mm − Máy xay, đồng nhất mẫu
− Bơm chân không − Bể siêu âm − Máy lắc ngang c. Cách tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
− Cân khoảng 25g mẫu đã được đồng nhất, thêm vào 5g NaCl cho vào bình tam giác có nút, 125ml dung dịch chiết (methanol : nước = 70 : 30), lắc trên máy lắc ngang 60 phút. Sau đó lọc qua giấy lọc thô.
− Lấy 15ml dung dịch lọc, thêm vào 30ml nước cất.
− Cho tất cả dung dịch này qua cột sắc ký ái lực với vận tốc khoảng 6 ml/phút. − Rửa cột sắc ký ái lực 2 lần bằng nước cất với vận tốc khoảng 6 ml/phút − Rửa rải aflatoxin bằng 2ml methanol
− Thổi khô dung dịch mẫu kiểm tra aflatoxin bằng khí nitơ
Bước 2: Tạo dẫn xuất aflatoxin
− Hòa tan chuẩn hoặc mẫu thử bằng 200µl n –hecxan − Thêm vào 50 µl trifluro acetic acid
− Để tại nhiệt độ phòng 5 phút
− Thêm vào mẫu 2 ml dung dịch acetonitril: nước (10:90) − Lắc mạnh, để yên cho tách lớp.
− Dùng syringe lấy lớp nước ở dưới − Lọc qua phin lọc mẫu 0,45 µm
Bước 3: Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc từ dung dịch
10ppb từ dung dịch chuẩn mẹ: Lấy 2ml dung dịch chuẩn 10ppb thổi khô bằng khói nitơ. Dung dịch này được sử dụng để tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid.
Bước 4: Xác định aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng
− Bước sóng kích thích 360nm, bước sóng phát xạ 440nm − Tốc độ dòng 1,2ml/phút
− Cột sắc ký Inertsil – ODS – 3V (RP18) − Thể tích tiêm mẫu 20 µl.
− Thời gian chạy sắc ký 15phút
− Thời gian lưu của aflatoxin khoảng 5 – 15 phút. d. Tính kết quả
Nồng độ aflatoxin (µg/kg): m: Khối lượng cân (g) Cc:Nồng độ chuẩn (ppb) Sm: Diện tích peak mẫu Sc: Diện tích peak chuẩn
V: Thể tích cuối cùng để đo (ml)
Kiểm soát chất lượng: Kết quả cuối cùng bằng giá trị trung bình của hai phép thử song song. Giá trị thu được từ hai phép thử song song không được chênh lệch nhau quá 20% so với giá trị trung bình.