I 2+ SO 2+ 2H2O = 2H + H2SO
4.7.4. Xác định chất bảo quản sorbic, benzoic bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
cao áp
a. Nguyên tắc
Acid sorbic, acid benzoic được tách ra khỏi thực phẩm bằng quá trình thuỷ phân với NaOH và chiết tách bằng methanol. Hàm lượng acid benzoic, acid sorbic sau đó được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA.
Phạm vi áp dụng: Qui trình này áp dụng cho các loại nước giải khát, sản phẩm thịt, cá đóng hộp và các loại bột.
Tài liệu trích dẫn: AOAC 971.15-2000 b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị
− Dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm
− Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detector PDA − Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g
− Cân kỹ thuật với độ chính xác 0,01g − Ống ly tâm dung tích 50ml
− Dung dịch NaOH 1N: Cân 40g NaOH, hoà tan và định mức 1000ml bằng nước cất
− Dung dịch NaOH 0,1N: cân 4g NaOH, hoà tan và định mức 1000ml bằng nước cất
− Dung dịch H2SO4 10%
− Dung dịch K3Fe(CN)6 0,32M: cân 10,6g K3Fe(CN)6, hoà tan bằng nước cất và định mức 100ml
− Dung dịch (CH3COO)2Zn 1M: cân 21,9g (CH3COO)2Zn.2H2O, hoà tan và định mức 100ml bằng nước cất.
− Dung dịch K2HPO4 0,2M: cân 4,56g K2HPO4.3H2O, hoà tan và định mức 100ml bằng nước cất.
− Dung dịch K2HPO4 0,02M: cân 4,56g K2HPO4.3H2O, hoà tan và định mức 1000ml bằng nước cất.
− Dung môi methanol: thuộc loại tinh khiết sắc ký
− Dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml (1000 ppm): cân chính xác 0,1g mỗi loại chuẩn vào cốc có mỏ 50ml, hoà trong 2-3 ml methanol cho tan hoàn toàn. Chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc và định mức vừa đủ 100ml bằng nước cất.
+Dung dịch chuẩn trung gian 100 ppm: hút chính xác 10ml hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất.
+Dung dịch chuẩn làm việc: lấy chính xác lần lượt 1, 5, 10, 20, 50 ml dung dịch chuẩn trung gian 100ppm vào các bình 100ml, định mức đến vạch bằng nước cất ta được dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ: 1, 5, 10, 20, 50ppm.
Bước 1: Xử lý mẫu
− Với mẫu dạng lỏng: hút chính xác 5-20 ml mẫu vào ống ly tâm 50ml. Thêm 2,5ml dung dịch NaOH 1N, lắc vortex.
− Với mẫu dạng rắn: cân chính xác 5-10g mẫu vào ống ly tâm, thêm 25ml dung dịch NaOH 0,1N, lắc vortex.
Sau đó, tất cả các mẫu được thuỷ phân cách thuỷ ở 70oC trong 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng. Chỉnh pH = 8 với H2SO410% (dùng giấy chỉ thị màu). Thêm 2ml K3Fe(CN)6 0,32M, đậy nắp, lắc. Thêm 2ml (CH3COO)2Zn 1M, đậy nắp, lắc. Thêm 10ml K2HPO4 0,2M và chuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 100ml, tráng rửa ống ly tâm và định mức đến vạch bằng methanol. Lọc mẫu qua giấy lọc thường, qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào HPLC.
Bước 2: Cài đặt thông số cho máy HPLC
− Cột: C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)
− Pha động: Dung dịch K2HPO4 0,02M: MeOH (95:5)
− Detector: PDA : λ = 193nm cho acid benzoic, 254nm cho acid sorbic và 230nm cho cả 2 acid
− Tốc độ dòng: 1ml/phút − Nhiệt độ buồng cột: 30oC − Thể tích tiêm mẫu: 50µl.
Bước 3: Lập đường chuẩn
Lần lượt tiêm dãy chuẩn vào hệ thống HPLC. Xây dựng đồ thị mối liên hệ giữa nồng độ chuẩn và diện tích peak. Khi phân tích cả 2 acid, lấy diện tích peak ở bước sóng 230nm.
d. Tính kết quả
Hàm lượng acid benzoic, acid sorbic trong mẫu được tính theo công thức sau: Xi: hàm lượng acid benzoic hoặc acid sorbic có trong mẫu (mg/l hoặc mg/kg)
Ci : nồng độ acid benzoic hoặc acid sorbic tính theo đường chuẩn V: thể tích định mức (100ml)
k: hệ số pha loãng
m: khối lượng mẫu (g hoặc ml)