4. Những đóng góp mới của luận án
1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase
1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới, gen mã hóa chitinase trên đối tượng vi sinh vật đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Zhu và đồng tác giả (2008) đã phân lập được gen mã hóa endochitinase từ nấm L. lecanii. Gen từ mARN dài 1272 bp mã hóa phân tử
protein gồm 223 amino acid có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa [151]. Trên chủng nấm L. psalliotae, Gan và đồng tác giả (2007) đã phân lập được gen mã
hóa chitinase từ mRNA dài 1272 bp mã hóa cho phân tử protein dài 423 amino acid, có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa [42].
Nghiên cứu trên nấm B. bassiana cho thấy, gen mã hóa chitinase từ DNA
dài 1047 bp, không chứa intron và mã hóa cho phân tử protein dài 348 amino acid. Phân tử protein tạo thành có kích thước khoảng 36 kDa [126]. Al-Rashed và đồng tác giả (2010) đã phân lập được gen mã hóa endochitinase từ mRNA dài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
966 bp mã hóa cho phân tử protein gồm 321 amino acid, có kích thước 35 kDa [16]. Từ nấm Paecilomyces javanicus, Chen và đồng tác giả (2007) đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ DNA có chiều dài 1035 bp, không chứa intron, mã hóa cho phân tử protein gồm 344 amino acid với khối lượng 37 kDa [28]. Ramli và đồng tác giả (2011) đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ mRNA của chủng nấm Glaciozyma antarctica PI12. Gen dài 1215 bp, mã hóa cho phân tử
protein gồm 403 amino acid với khối lượng 39 kDa [113].
Như vậy, gen mã hóa chitinase từ một số chủng nấm là khác nhau về số lượng, kích thước và trình tự sắp xếp của các nucleotide. Chitinase tái tổ hợp được tạo ra bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp mang đến một số thuận tiện trong quá trình sản xuất và tinh sạch. Hơn nữa, chitinase tái tổ hợp còn có thể có một số tính chất thay đổi theo hướng có lợi so với enzyme tự nhiên. Bên cạnh đó, việc sử dụng các hệ biểu hiện để tạo enzyme tái tổ hợp cũng rất quan trọng cho sự phát triển các enzyme mới và sản xuất lượng lớn các enzyme này. Gen mã hóa chitinase đã được nhiều tác giả nghiên cứu biểu hiện ở các hệ thống biểu hiện khác nhau.
1.4.1.1. Biểu hiện chitinase trong vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, thuận tiện cho các thao tác
sinh học phân tử nên được lựa chọn là hệ biểu hiện phổ biến dùng cho những mục đích khác nhau. Trong đó, gen mã hóa chitinase đã được tách từ các đối tượng sinh vật khác nhau và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli để tạo ra lượng lớn
phục vụ cho nhiều lĩnh vực.
Barboza-Corona và đồng tác giả (2003) đã nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa endochitinase từ vi khuẩn B. thuringiensis trong vi khuẩn E. coli DH5α.
Phân tử protein được tạo ra gồm 676 amino acid, có khối lượng 74 kDa. Nhiệt độ và pH tối ưu của chitinase tái tổ hợp lần lượt là 57,2°C và pH 6,0 [22].
Bên cạnh sự biểu hiện gen mã hóa chitinase ở các sinh vật nhân sơ trong vi khuẩn E. coli, nhiều gen mã hóa chitinase ở các nhóm Eucaryote cũng được biểu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hiện trong vi khuẩn E. coli với mục đích nghiên cứu khả năng biểu hiện của
chúng. Songjang và đồng tác giả (2006) đã phân lập gen mã hóa chitinase từ chủng nấm B. bassiana BCC3653 có kích thước 1047 bp và biểu hiện thành
công trong vi khuẩn E. coli TOP10 sử dụng vector pSE420, protein biểu hiện có kích thước ~36 kDa [126]. Năm 2008, Zhu và đồng tác giả đã phân lập và biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii trong vi khuẩn E. coli sử dụng vector pMAL-c2X. Protein tái tổ hợp có kích thước 88,4 kDa (do xuất hiện quá trình dimer hóa) và hoạt tính enzyme đạt tối đa 53,1 mU/ml [151].
Ngoài ra, gen mã hóa chitinase ở thực vật cũng được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu của Abd Elhamid và đồng tác giả (2010) đã phân lập gen mã hóa endochitinase dài 798 bp từ lúa mì Hordeum vulgare và biểu hiện ở vi khuẩn E. coli, protein tái tổ hợp được sinh ra có khối lượng 29 kDa gồm
266 amino acid. Enzyme này có khả năng chống lại một số tác nhân gây bệnh như sâu, bệnh đốm thuốc lá, nấm bệnh F. oxysporium và F. solani [15].
Tuy nhiên, các enzyme tái tổ hợp được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli còn gặp phải một số hạn chế như chúng không hình thành được đúng cấu trúc giống trong tự nhiên và các protein được biểu hiện cao thường ở dạng không tan. Thêm vào đó, quá trình sửa đổi sau dịch mã rất cần thiết để hình thành các protein có hoạt tính đã không xảy ra ở vi khuẩn E. coli. Để giải quyết vấn đề này, các
nghiên cứu đi theo hướng đưa các protein tái tổ hợp tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy bằng cách sử dụng các promoter, trình tự tín hiệu và các vật chủ khác nhau để biểu hiện ở một số điều kiện hoặc biểu hiện cùng các chaperone giúp hình thành các protein có hoạt tính. Ngoài ra, protein ngoại bào còn có một số thuận lợi so với protein nội bào như là hầu hết nó ở dạng hòa tan, có hoạt tính sinh học và ít bị phân cắt bởi protease. Đặc biệt, việc tinh sạch protein ngoại bào đơn giản và ít tốn kém hơn nội bào [29].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.4.1.2. Biểu hiện chitinase trong vi khuẩn Bacillus
Ngoài việc sử dụng vi khuẩn E. coli là hệ biểu hiện, vi khuẩn Bacillus được coi là đối tượng giúp nâng cao năng suất biểu hiện. Nghiên cứu của Okay và đồng tác giả (2005) nhận thấy, khi sử dụng vi khuẩn B. thuringensis biểu hiện
gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn S. marcescens BN10 sử dụng vector pHT315
với promoter cry3Aa11 hoạt tính riêng của enzyme tái tổ hợp đạt 5056 U/phút/mg và hiệu suất cao gấp 6,3 lần so với chủng gốc [101].
1.4.1.3. Biểu hiện chitinase trong nấm men
Một số chitinase từ các loài nấm sợi hoặc sinh vật bậc cao đã được biểu hiện thành công ở nấm men P. pastoris và S. cerevisia. Gan và đồng tác giả
(2007) đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ nấm L. psalliotae trong nấm men P. pastoris GS115 bằng việc sử dụng vector pPIC9K. Protein tái tổ hợp tạo
thành có khối lượng 45 kDa, được mã hóa bởi 423 amino acid; protein này có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 37,6°C và pH 7,0 [42].
Năm 2012, Prasad và Palanivelu đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ chủng nấm T. lanugunosus ATCC 44008 và biểu hiện trong nấm men
S. cerevisiae SEY 2101. Chitinase tái tổ hợp được tạo ra có khối lượng khoảng
42 kDa, hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 60°C và pH 6,5. Enzyme này duy trì hoạt tính trên 60% sau ủ 6 giờ ở 50°C [108]. Gen mã hóa endochitinase từ chủng nấm T. virens UKM1 được phân lập có chiều dài 1169 bp và biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33 sử dụng vector pPICZαC. Protein tái tổ hợp tinh sạch có
khối lượng 35 kDa, nhiệt độ và pH tối lần lượt là 35°C và pH 6,0. Enzyme này bền ở dải nhiệt độ từ 30-55°C, dải pH từ 5,0-7,0 và hoạt tính riêng đạt 1,34 U/mg protein [16].
1.4.1.4. Biểu hiện chitinase trong thực vật
Bên cạnh việc đưa gen mã hóa chitinase từ các vi sinh vật biểu hiện trong vi khuẩn, nấm men, một số tác giả đã biểu hiện các gen mã hóa chitinase từ vi sinh vật trong thực vật nhằm giúp thực vật nâng cao sức đề kháng với tác nhân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
gây bệnh. Từ nấm M. anisopliae, Kern và đồng tác giả (2010) đã phân lập được gen mã hóa endochitinase dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35S và chuyển vào cây thuốc lá. Sau đó tiến hành sàng lọc các dòng thuốc lá tái tổ hợp, thu được 2 dòng biểu hiện hoạt tính chitinase cao và có khả năng chống lại nấm bệnh R. solani [63]. Rana và đồng tác giả (2012) phân lập 2 gen mã hóa chitinase và chitosanase từ nấm T. harzianum và chuyển vào cây lúa mì Triticum aestivum L giúp cây có khả năng chống lại nấm mốc trắng [114].
Ngoài việc đưa các gen mã hóa chitinase từ vi sinh vật vào thực vật, các gen mã hóa chitinase từ động vật cũng được được chuyển vào trong thực vật giúp thực vật có khả năng chống lại các loài côn trùng gây bệnh. Nghiên cứu của Ding và đồng tác giả (1998) nhận thấy, cây thuốc lá chuyển gen chitinase từ côn trùng có khả năng chống lại sâu bướm (Heliothis virescens). Ấu trùng bướm giảm đáng kể sau khi ăn phải thuốc lá chuyển gen [35].
Ngoài ra, một số tác giả cũng phân lập gen mã chitinase từ thực vật và chuyển vào thực vật giúp thực vật nâng cao khả năng tiết chitinase. Nirala và đồng tác giả (2010) đã nghiên cứu qui trình chuyển gen mã hóa chitinase từ cây lúa vào cây nho (Vitis vinifera L.) sử dụng vector pGL2 nhờ vi khuẩn
A. tumerfaciens nhằm tăng khả năng kháng lại nấm bệnh hại cây trồng [98].
1.4.2. Ở Việt Nam
Cho đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu về chitinase dựa trên những ứng dụng trong việc xử lý môi trường và khả năng ức chế chống lại nấm bệnh hại cây trồng.
Nghiên cứu về vai trò của chitinase đã được một số tác giả chứng minh như: Nguyễn Thị Tuyết Nhung và đồng tác giả (2004) khi nghiên cứu khả năng đối kháng nấm F. oxysporum và Phytophthora của một số chủng vi khuẩn đã
phân lập được vi khuẩn S. liquefaciens 1A8 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao trong môi trường có chứa chitin keo, ở 20°C và pH 7,0; trong dãy nồng độ NaCl 0,25-3,0% sau 48 giờ nuôi [10]. Khi nghiên cứu về cơ chất cảm ứng cho
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
quá trình sinh tổng hợp chitinase, Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (2003) nhận thấy nấm T. harzianum có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao khi sử
dụng chitin vỏ tôm, chitin vách tế bào nấm và CMC; trong đó chitin từ vách tế bào nấm kích thích chitinase sinh ra cao nhất (đạt 5589,72 đvht/ml) sau 4 ngày. Chitinase từ nấm T. harzianum có khả năng phân hủy vách khuẩn ty nấm S. rolfsii, làm cho khuẩn ty nấm S. rolfsii nhăn nheo, đứt vụn và biến dạng [2].
Năm 2007, Đinh Minh Hiệp và đồng tác giả đã khảo sát hoạt tính chitinase từ một số chủng nấm Trichoderma phân lập tại Việt Nam. Kết quả cho thấy, có
24/92 chủng nấm Trichoderma cho hoạt tính chitinase cao (hoạt tính ≥ 14x10-2
đvht/ml) [5]. Trong số 36 chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất vùng Đông
Nam Bộ, chủng Trichoderma TĐ14 sinh chitinase cao nhất sau 7 ngày nuôi được sử dụng để tạo chitinase. Chế phẩm chitinase thô có hoạt tính đạt 18,93 đvht/mg protein sau khi tủa với muối (NH4)2SO4 75% bão hòa được sử dụng để nghiên cứu khả năng kháng nấm C. albicans. Kết quả cho thấy, chế phẩm này có khả
năng kháng nấm C. albicans ở nồng độ 2 mg/ml, giá trị MIC (nồng độ chitinase thấp nhất mà ở nồng độ đó không còn quan sát thấy sự phát triển của vi nấm gây bệnh) là 4 mg/ml [6].
Quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase cũng là hướng nghiên cứu được thực hiện. Năm 2012, bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, Quách Ngọc Tùng và đồng tác giả đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho vi khuẩn
B. licheniformis DS23 sinh tổng hợp chitinase cao nhất. Môi trường tối ưu gồm
(g/l) cao nấm men 5,9; pepton 4,9; chitin 7,2; KH2PO4 0,5 sau 48 giờ lên men ở 30°C, hoạt tính chitinase đạt 110,3 U/ml, cao gấp 3,2 lần so với trước tối ưu. Chitinase thô từ chủng này hoạt động tốt ở dải nhiệt độ 40-70°C và pH 5,0-7,0; một số ion kim loại như Co2+
, Mn2+, Ca2+ ở nồng độ 1 và 100 mM làm tăng hoạt tính enzyme; trong khi các ion Ba2+, Fe2+ và Sn2+ ở nồng độ tương ứng làm giảm hoạt tính enzyme [11]. Năm 2013, Vũ Thị Thanh và đồng tác giả đã phân lập được chủng nấm Penicillium sp. M4 có hiệu lực diệt rệp ngô cao (đạt 92,3% sau 7 ngày phun) và được sử dụng để nghiên cứu khả năng sinh chitinase. Điều kiện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm Penicillium sp. M4 sinh tổng hợp chitinase tối ưu trong môi trường lên men rắn với nguồn cơ chất bột ngô có độ dày 17 mm, độ ẩm cơ chất 60%, bổ sung 1,0% chitin ở pH 6,0; nồng độ urê 0,9%; nhiệt độ 30°C sau 5 ngày nuôi cấy hoạt tính chitinase đạt 8,02 U/ml [13]. Nguyễn Ngọc Mai và đồng tác giả (2013) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ chủng nấm L. lecanii
Le85 bằng kỹ thuật đột biến sử dụng tia UV kết hợp với N-methyl-N’-nitro-N- nitrosoguanidine (NTG) đã thu được dòng đột biến N30.8 cho hoạt tính chitinase cao hơn 2,85 lần so với dòng ban đầu (hoạt tính đạt 1,12 U/ml) [8]. Dòng đột biến N30.8 được Nguyễn Hồng Minh và đồng tác giả (2013) sử dụng để tối ưu sinh chitinase trong môi trường lên men xốp. Kết quả đã chọn được môi trường tối ưu gồm hỗn hợp bột ngô và cám gạo với tỉ lệ phối trộn là 6:4, bổ sung 0,1% chitin, 50% độ ẩm; 0,1% NH4Cl làm nguồn nitơ; 0,1% MgSO4 ở 30°C; pH 6,0. Sau 4 ngày lên men, hoạt tính chitinase cao gấp 1,8 lần so với trước tối ưu (hoạt tính đạt 1,611 U/ml) [9].
Đinh Duy Kháng và đồng tác giả (1999) đã tinh sạch được chitinase từ cây đậu tương thông qua 4 bước, chitinase tinh sạch có khối lượng phân tử 30,6 kDa. Tuy nhiên, chitinase tinh sạch không có hoạt tính kháng nấm mốc khi thử với nấm T. reesei [4], có thể chitinase ở hạt đậu tương có một vai trò khác như tham gia vào quá hình thành phôi trong quá trình phát triển của hạt. Khi nghiên cứu động học của quá trình hoạt hóa chitinase trong phản ứng thủy phân chitin, Trần Đình Toại và đồng tác giả (2008) nhận thấy proflavine làm tăng tốc độ phản ứng thủy phân chitin và được coi là chất hoạt hóa chitinase từ vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa [12].
Hướng nghiên cứu về gen mã hóa chitinase được một số tác giả nghiên cứu chủ yếu trên thực vật, giúp thực vật có khả năng kháng lại bệnh. Đặng Trọng Lương và đồng tác giả (2005) đã nghiên cứu quá trình chuyển gen chitinase kháng nấm vào cây lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng plasmid
pBI333-EN4-RCC2, kết quả thu được 6 mẫu lúa DT10 và 4 mẫu lúa DT13 mang gen biến nạp [3]. Năm 2009, Bùi Thị Lan Hương và đồng tác giả đã phân lập gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
mã hóa chitinase từ cây đậu Pysium và chuyển vào cây cà chua nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, giúp cây cà chua có khả năng kháng nấm gây bệnh cây [1]. Hà
Hồng Hạnh và đồng tác giả (2013) tiến hành phân lập gen mã hóa chitinase từ cây ca cao thương mại TD3 và tạo dòng thành công trong vector pJET1.2 và pPIPRA522 để xác định cấu trúc hoàn chỉnh. Gen sau đó đưa vào vector biểu hiện pCB301+TcCh1 và chuyển vào cây thuốc lá dòng C9-1 thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens theo phương pháp mảnh lá nhằm bước đầu nghiên cứu sự biểu
hiện của cấu trúc gen chuyển, tạo cơ sở cho việc chuyển gen mã hóa chitinase vào cây ca cao giúp tăng cường biểu hiện chitinase trong cây [7].
Như vậy, ở Việt Nam hướng nghiên cứu chitinase chủ yếu tập trung vào quá trình tối ưu khả năng sinh chitinase trên một số chủng vi sinh vật và sử dụng chitinase để ức chế sự phát triển, cũng như nghiên cứu biểu hiện gen chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại được một số nấm bệnh. Do đó, quá trình tinh sạch và nhân dòng gen mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii và
ứng dụng của chitinase từ nấm này trong kiểm soát sinh học rệp và nấm bệnh hại cây trồng là một hướng nghiên cứu mới ở Việt Nam. Hướng nghiên cứu này góp phần nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng.