4. Những đóng góp mới của luận án
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P pastoris
3.4.2.1. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPChit
Để biểu hiện cDNA gen Chit, plasmid tái tổ hợp pPIChit1 được cắt mở
vòng bằng PmeI thu được 1 băng có kích thước ~5,0 kb (ứng với kích thước của vecor pPICZαA và cDNA gen Chit) (Hình 3.17C), sau đó được biến nạp vào
genome của nấm men P. pastoris X33 với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp
biểu hiện rChit hiệu quả, bền và ổn định đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris X33
Giếng ĐC: khuôn pPIChit, giếng 1-11: khuôn DNA từ các dòng tái tổ hợp, giếng 12: khuôn DNA của nấm men P. pastoris X33 gốc, giếng M: marker
Các dòng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường YPG bổ sung zeocin qua đêm, tách DNA, sau đó PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra. Một số khuẩn lạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(1-4, 6-11) (Hình 3.18) có kích thước tương ứng với cDNA gen Chit. Như vậy, có thể kết luận các dòng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp có chứa đoạn gen Chit.
3.4.2.2. Sàng lọc các dòng nấm men P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp
Sau khi biến nạp, 32 dòng tái tổ hợp được nuôi và xác định mức độ biểu hiện rChit. Bảng 3.3 nhận thấy, 29 dòng có hoạt tính chitinase và 3 dòng không có hoạt tính. Trong đó, dòng số 18 có hoạt tính chitinase cao nhất (0,636 U/ml). Dòng số 18 được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men P. pastoris X33/pPChit
tái tổ hợp Các dòng U/ml Các dòng U/ml S1 0,602 ± 0,0002 S17 0,000 ± 0,0000 S2 0,427 ± 0,0003 S18 0,636 ± 0,0002 S3 0,456 ± 0,0019 S19 0,255 ± 0,0003 S4 0,382 ± 0,0006 S20 0,323 ± 0,0002 S5 0,367 ± 0,0009 S21 0,274 ± 0,0004 S6 0,434 ± 0,0004 S22 0,309 ± 0,0002 S7 0,296 ± 0,0003 S23 0,274 ± 0,0003 S8 0,454 ± 0,0006 S24 0,368 ± 0,0014 S9 0,296 ± 0,0003 S25 0,268 ± 0,0004 S10 0,316 ± 0,0002 S26 0,000 ± 0,0000 S11 0,534 ± 0,0002 S27 0,265 ± 0,0001 S12 0,272 ± 0,0014 S28 0,258 ± 0,0002 S13 0,581 ± 0,0006 S29 0,253 ± 0,0004 S14 0,392 ± 0,0013 S30 0,336 ± 0,0003 S15 0,521 ± 0,0004 S31 0,326 ± 0,0005 S16 0,374 ± 0,0004 S32 0,000 ± 0,0000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.4.2.3. Lựa chọn môi trường biểu hiện
Để khảo sát môi trường biểu hiện rChit, dòng số 18 được nuôi trong các môi trường khác nhau (BMM, BMMY, YB+YNB, YP, MM và MMY). Hoạt tính biểu hiện rChit cao nhất trong môi trường YP, hoạt tính đạt 0,753 U/ml (Bảng 3.4). Môi trường YP được lựa chọn để biểu hiện rChit cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.4. Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau
Môi trƣờng OD600nm U/ml
BMM 4,21 0,605 BMMY 5,01 0,632 YP+YNB 5,44 0,446 YP 5,46 0,753 MM 4,09 0,254 MMY 5,78 0,506 3.4.2.4. Lựa chọn nồng độ methanol
Trong quá trình biểu hiện, methanol đóng vai trò cảm ứng promoter AOX1 kiểm soát quá trình sinh enzyme. Mức độ biểu hiện rChit tăng dần khi tiếp methanol từ nồng độ 0-2,5% và đạt cực đại ở nồng độ 1,5%, hoạt tính đạt 1,094 U/ml (Hình 3.19A). Điện di đồ hình ảnh protein tổng số biểu hiện tối ưu nồng độ methanol, băng 45 kDa ở nồng độ mathanol 1,5% rất đậm (Hình 3.19B).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ứng ở các nồng độ methanol khác nhau A. Hoạt tính rChit và động thái sinh trưởng
B. Điện di đồ kiểm tra protein trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, giếng 1-5 ứng với nồng độ methanol lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5
3.4.2.5. Lựa chọn thời gian nuôi biểu hiện
Khi nuôi cấy nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp, hoạt tính rChit cao nhất đạt 1,11 U/ml sau 96 giờ nuôi cấy và giảm dần ở 120 giờ (đạt 1,05 U/ml) (Hình 3.20A). Điện di đồ hình ảnh protein tổng số được biểu hiện theo thời gian nuôi cấy, băng 45 kDa đậm dần theo thời gian nuôi (Hình 3.20B).
Với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp có năng suất biểu hiện và hoạt tính enzyme cao hơn so với chủng tự nhiên nhằm định hướng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học, đồng thời thuận lợi hơn cho các nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của enzyme. Gen Chit mã hóa rChit từ chủng nấm L. lecanii 43H được biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33. rChit được biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính 1,11 U/ml, thời gian biểu hiện là 96 giờ, tiếp methanol 1,5%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A. Hoạt tính rChit và động thái sinh trưởng
B. Điện di đồ kiểm tra protein trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, Giếng 1; 2; 3; 4; 5 ứng với thời gian nuôi biểu hiện lần lượt là 24; 48; 72; 96 và 120 giờ
Theo nghiên cứu của một số tác giả trước như Hamsah (2009) đã tối ưu quá trình biểu hiện chitinase trong vi khuẩn E. coli bằng phương pháp lên men bề
mặt sử dụng chất cảm ứng là IPTG và lactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cảm ứng IPTG ở nồng độ 1,19 mM và lactose ở nồng độ 0,98%, hoạt tính chitinase tái tổ hợp được sinh ra cao gấp 13,2 lần so với ban đầu (hoạt tính đạt 0,513 U/ml) [50]. Gen mã hóa chitinase từ nấm Thermomyces lanuginosus cũng được biểu hiện trong nấm men S. cerevisia để nâng cao năng suất biểu hiện tạo
chitinase. Kết quả cho thấy, chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao khi môi trường bổ sung chitin huyền phù 0,2% sau 4 ngày nuôi [108]. Al-Rashed và đồng tác giả (2010) cũng đã biểu hiện endochitinase từ chủng
T. virens trong nấm men P. pastoris X33, hoạt tính chitinase được sinh ra tăng
đáng kể so với chủng tự nhiên. Môi trường BMMY được sử dụng để tối ưu tăng hoạt tính endochitinase tái tổ hợp khi bổ sung methanol 0,5% sau mỗi 24 giờ trong 120 giờ nuôi cấy [16]. Năm 2012, Tang và đồng tác giả đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ nấm T. asperellum trong nấm men P. pastoris GS-tachi1-K. Kết quả nghiên cứu đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho quá trình tạo chitinase tái tổ hợp gồm methanol 0,5%, ở pH 6,5 sau 180 giờ nuôi; hoạt tính chitinase tái tổ hợp đạt 17,93 U/ml và năng suất biểu hiện là 6,19 g/l [133].
Như vậy, hướng nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn phù hợp so với một số nghiên cứu trên. Cách tiếp cận khi biểu hiện gen đều xuất phát từ khâu lựa chọn hệ biểu hiện, sau đó tối ưu môi trường biểu hiện và đều đạt được mục đích là nâng cao năng suất biểu hiện so với chủng tự nhiên. Kết quả của các nghiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cứu đã chỉ ra được sự khác nhau giữa các đối tượng (nguồn vi sinh vật cung cấp gen, đặc tính của gen và hệ biểu hiện) dẫn tới năng suất biểu hiện là khác nhau.
Năng suất biểu hiện rChit (trong nghiên của chúng tôi) với chitinase tái tổ hợp do gen mã hóa được phân lập ở một số loài nấm có quan hệ gần như
L. psalliotae hay L. lecanii là khác nhau. Gan và đồng tác giả (2007) đã biểu
hiện thành công gen mã hóa chitinase từ nấm L. psalliotae trong nấm men P. pastoris GS115 sử dụng vector pPIC9K. Tuy nhiên, hoạt tính chitinase tái tổ
hợp thu được chỉ đạt 15 mU/ml [42]. Zhu và đồng tác giả (2008) biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii trong vi khuẩn E. coli sử dụng
vector pMAL-c2X. Chitinase tái tổ hợp được tạo ra có hoạt tính 53 mU/ml, sau khi cảm ứng 0,3 mM IPTG, trong 4 giờ ở 37°C [151]. Như vậy, hoạt tính rChit đạt được cao hơn nhiều lần so với công bố của Gan và đồng tác giả (2007), Zhu và đồng tác giả (2008). Hơn nữa, nấm men P. pastoris X33 là hệ thống biểu hiện tốt và an toàn hơn so với các hệ biểu hiện khác. Do đó, chủng nấm men
P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp được lựa chọn để biểu hiện, tinh sạch và đánh
giá tính chất của rChit.