4. Những đóng góp mới của luận án
3.4.3. Tinh sạch rChit
rChit từ nấm men P. pastoris X33 có hoạt tính 1,11 U/ml (hoạt tính riêng
đạt 11,21 U/mg protein). Dịch enzyme này được cô lại bằng cột Millipore 10 kDa có hoạt tính đạt 11,54 U/mg protein, độ sạch là 1 và hiệu suất thu hồi đạt 92%. Dịch enzyme sau khi cô lại được đưa lên cột DEAE-Sephadex A-50. rChit đã được tinh sạch với độ sạch 1,8 lần và hiệu suất thu hồi đạt 10%. rChit tinh sạch có hoạt tính 11,93 U/mg protein (Bảng 3.5) và chỉ ra một băng protein duy nhất trên bản gel nhuộm bằng AgNO3 0,1%, khối lượng phân tử của protein này khoảng 45 kDa (Hình 3.21). Như vậy, rChit từ nấm men P. pastoris X33 đã
được tinh sạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bước tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt tính tổng số (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg) Độ sạch (lần) Hiệu suất (%) Enzyme thô 4,95 55,5 11,21 1,0 100,0
Enzyme cô mẫu 4,41 50,9 11,54 1,0 92,0
DEAE -
Sephadex A50 0,27 5,4 19,93 1,8 10,0
Sử dụng chương trình NetOGlyC-3.1 cho thấy, trình tự đoạn gen Chit
không chứa vị trí O-glycosyl hóa. Do đó, theo tính toán lý thuyết kích thước của rChit từ trình tự amino acid suy diễn đạt khoảng 45 kDa. Khi tiến hành tinh sạch rChit qua cột Millipore 10 kDa và DEAE-Sephadex A-50, chúng tôi thu được phân tử protein có khối lượng khoảng 45 kDa đúng như dự đoán theo lý thuyết. rChit có hoạt tính riêng đạt 19,93 U/mg protein và được xếp vào nhóm III (có MW từ 40-50 kDa).
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33
Giếng 1: dịch nổi, giếng 2: dịch lên cột DEAE-Sephadex A50, giếng 3-9: ứng với các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A50 có hoạt tính chitinase lần lượt là 11-14, 16-18. giếng M: marker.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thông thường, các enzyme tái tổ hợp được gắn thêm đuôi 6x histidine để thuận tiện trong tinh sạch và nâng cao hiệu quả tinh sạch. Các enzyme tái tổ hợp này thường sử dụng cột ProbondTM
resin để tinh sạch.
Nghiên cứu của Ramli và đồng tác giả (2011) đã sử dụng cột HisTrapTM HP để tinh sạch chitinase tái tổ hợp từ nấm men P. pastoris GS115 thu được enzyme tinh sạch có kích thước khoảng 39 kDa [113]. Gan và đồng tác giả (2007) sử dụng cột sắc khí lọc gel khi tinh sạch chitinase tái tổ hợp ở nấm men P. pastoris GS115 đã thu được một băng protein có kích thước 45 kDa [42]. Năm 2005, Ruiz-Sanchez và đồng tác giả đã tinh sạch chitinase tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli DH5α thông qua cột sắc khí tương tác kị nước và thu được một băng protein có kích thước 61 kDa [120]. Chitinase tái tổ hợp do gen từ nấm L. lecanii mã hóa
được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli DH5α được Zhu và đồng tác giả (2008)
tinh sạch qua cột sắc khí ái lực có gắn hạt resin có kích thước 88,4 kDa (do xuất hiện quá trình dimer hóa) [151].
Chitinase A tái tổ hợp do gen từ Pseudomonas sp. BK1 mã hóa được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli dưới dạng thể vùi và quá trình tinh sạch đã sử dụng urê 8M để tạo thành dạng thể tan sau đó loại bỏ urê. ChitinaseA thu được có kích thước khoảng 55 kDa [58]. Trong khi, chitinase tái tổ hợp do gen từ nấm
Paecilomyces thermophila mã hóa được biểu hiện trong E. coli ở dạng thể tan và
được tinh sạch qua cột sắc khí Ni-IDA [75].
Từ các nghiên cứu trên cho thấy, mỗi loại chitinase tái tổ hợp có thể được sử dụng một pháp tinh sạch khác nhau. Trong nghiên cứu của chúng tôi, rChit được tạo thành có chứa đuôi 6x histidine đã được kiểm tra qua phần mềm DNAstar. Tuy nhiên, khi sử dụng cột ProbindTM
resin để tinh sạch chitinase, chúng tôi đã thu được enzyme hoàn toàn sạch, nhưng hoạt tính thủy phân chitin không còn. Do đó, chúng tôi đã không sử dụng cột ProbondTM
resin để tinh sạch rChit mà sử dụng cột DEAE-Sephadex A-50. Cách tiếp cận này đã giúp chúng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tôi đạt được mục đích trong quá trình tinh sạch là đảm bảo được hoạt tính của chitinase, hiệu suất tinh sạch cao hơn so với enzyme tự nhiên.