4. Những đóng góp mới của luận án
3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L.lecan
3.2.2.1. Xác định nhiệt độ và pH thích hợp
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ
20-70 C. Hoạt tính chitinase tăng dần từ 185,1 U/mg ở 20°C đến tối đa 663,9 U/mg ở 40°C và giảm dần đến 64,5 U/mg ở 70°C (Hình 3.8A). Chitinase này cũng hoạt động ở dải pH rộng từ 3,5 đến 8,0. Hoạt tính chitinase tăng dần từ 61,7 U/mg ở pH 3,5 đến tối đa 568,2 U/mg ở pH 6,0 và giảm xuống đến 436,4 U/mg ở pH 7,5 (Hình 3.8B).
Các nghiên cứu nhận thấy, giá trị pH từ 4,0-6,0 và nhiệt độ từ 40-60°C là tối ưu cho chitinase từ các chủng nấm như Talaromyces flavus CGMCC 3.4301
[81], M. anisopliae [61], A. fumigate [145], Verticillium sp. [142] và G. catenulatum [86] hoạt động. Trong khi, pH và nhiệt độ tối ưu cho chitinase từ
chủng nấm L. lecanii 43H lần lượt ở pH 6,0 và 40°C. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp so với nghiên cứu đã công bố.
A B
Hình 3.8. Nhiệt độ (A) và pH (B) thích hợp của chitinase
3.2.2.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H bền ở nhiệt độ 30, 37 và 40 C sau
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trì trên 40% sau khi ủ trong 60 giờ ở 30 C và cao hơn khi ủ ở 37 và 40 C. Hoạt tính chitinase giảm đáng kể sau khi ủ trong 84 giờ và mất hoạt tính ở 40 C (Hình 3.9A). Enzyme này cũng bền ở pH 6,0 sau khi ủ trong 36 giờ và hoạt tính duy trì 56% so với đối chứng. Trong khi đó, ở dải pH từ 4,0-5,0 và 7,0-8,0 hoạt tính chitinase giảm mạnh so với đối chứng và hoạt tính còn lại thấp hơn 40% sau khi ủ trong 48 giờ (Hình 3.9B).
Hầu hết chitinase từ các chủng nấm thường tỏ ra bền với nhiệt độ lên đến 40 C và độ bền pH trong dải từ 4,0-6,0. Trong điều kiện này, hoạt tính chitinase giữ lại trên 80% so với hoạt tính ban đầu sau thời gian ủ nhất định. Manthivanan và đồng tác giả (1998) nhận thấy, chitinase từ nấm F. chlamydosporum bền ở
nhiệt độ 40 C và dải pH từ 4,0-6,0 [87]. Chitinase từ nấm G. catenulatum bền ở dải pH từ 4,0-5,0 và dải nhiệt độ từ 20-40 C [86]. Chitinase từ vi khuẩn
S. marcescens bền ở pH 5,0-7,0 và nhiệt độ 50 C, hoạt tính duy trì trên 80% sau
khi ủ trong 2 giờ [148]. Chitinase A từ vi khuẩn Serratia sp. KCK là một
exochitinase bền ở dải pH rộng từ 5,0-10 và ở nhiệt độ 40 C [67]. Như vậy, kết quả của chúng tôi phù hợp với một số kết quả đã công bố là chitinase bền ở dải pH từ 4,0-6,0 và nhiệt độ từ 20-40 C. Từ các dẫn liệu trên, chúng tôi có thể khảng định chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H khá bền, có thể bảo quản ở
nhiệt độ phòng và thuận lợi hơn trong nghiên cứu enzyme; đặc biệt là trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm trong quá trình thủy phân côn trùng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A B
Hình 3.9. Độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của chitinase
3.2.2.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA lên hoạt tính của chitinase
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại ở các nồng độ khác nhau tới hoạt tính chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H cho thấy, các ion Ba2+, Cu2+, K+, Mg2+, Ni2+, Zn2+ và EDTA ở nồng độ 5-15 mM; ion Fe2+, Mn2+ ở nồng độ 5-10 mM; ion Ca2+ở nồng độ 5 và 15 mM làm tăng hoạt tính chitinase từ 44-126%. Trong khi việc bổ sung các ion Ag+, Hg2+, Al3+ ở 3 nồng độ khảo sát làm giảm mạnh hoạt tính chitinase xuống còn một nửa so với hoạt tính ban đầu (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase Ion kim loại
và EDTA
% hoạt tính tƣơng đối của chitinase ở các nồng độ
5 mM 10 mM 15 mM Zn2+ 144,0 ± 3,7 192,0 ± 5,6 226,0 ± 8,5 Ca2+ 115,0 ± 2,5 98,0 ± 4,8 166,0 ± 6,1 Cu2+ 130,0 ± 0,7 142,0 ± 8,7 156,0 ± 14,1 Ba2+ 113,0 ± 0,1 122,0 ± 4,6 156,0 ± 18,7 Ni+ 135,0 ± 3,6 128,0 ± 10,2 157,0 ± 8,9 K+ 107,0 ± 6,8 102,0 ± 5,9 128,0 ± 1,3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mg2+ 130,0 ± 0,3 123,0 ± 6,8 101,0 ± 1,3 Fe2+ 131,0 ± 7,4 128,0 ± 2,6 71,0 ± 0,1 Mn2+ 98,0 ± 8,2 113,0 ± 2,7 56,0 ± 0,0 Ag+ 72,0 ± 2,3 56,0 ± 0,0 58,0 ± 1,4 Al3+ 62,0 ± 1,6 67,0 ± 4,0 56,0 ± 0,0 Hg2+ 56,0 ± 0,0 56,0 ± 0,0 56,0 ± 0,0 EDTA 156,0 ± 6,2 122,0 ± 6,5 101,0 ± 4,5 ĐC 100,0 ± 3,2
Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc định hình cấu trúc không gian của phân tử enzyme hoặc trong một vài trường hợp nó là nhân tố cần thiết trong trung tâm hoạt động của enzyme. Do đó, các ion kim loại có ảnh hưởng lớn tới khả năng hoạt động của enzyme. Nghiên cứu của Ma và đồng tác giả (2012) nhận thấy, hoạt tính của chitinase từ chủng nấm G. catenulatum HL-11 tăng lên khi bổ sung hai ion kim loại Co2+
và Ca2+ ở nồng độ 5 mM. Trong khi, các ion Fe2+, Na+, K+, Zn2+, Mn2+ làm giảm nhẹ hoạt tính chitinase và hoạt tính giảm mạnh khi bổ sung các ion Fe3+
, Cu2+ và Ag+ [86]. Annamalai và đồng tác giả (2010) nhận thấy, việc bổ sung các ion Mn2+
, Fe2+, Ni2+ và Ca2+ ở nồng độ 5 mM làm tăng hoạt tính chitinase của vi khuẩn Micrococcus sp. AG84; trong khi,
chitinase này bị ức chế bởi EDTA, Cu2+
, Hg2+ và Co2+ [19]. Chitinase từ chủng nấm Arthrobacter hydrophila H-2330 [100] và F. chlamydosporum [87] bị ức chế bởi ion Fe2+
, Fe3+ và Cu2+. Tsujibo và đồng tác giả (1992) nhận thấy, hoạt tính chitinase từ chủng nấm Alteromonas sp. O-7 tăng khi ủ với ion Na+
và Ca2+ [139]. Từ những nghiên cứu trên cho thấy, hoạt tính chitinase ở nhiều vi sinh vật được tăng lên khi bổ sung ion Ca2+
và giảm xuống khi bổ sung ion Ag+ giống như chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H chúng tôi nghiên cứu. Nhận định trên có thể chứng minh vai trò của ion kim loại trong hoạt động xúc tác thủy phân cơ chất của chitinase.
3.2.2.4. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase
Tác động của các chất tẩy rửa mang điện (SDS) và không mang điện (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và Triton X-114) hiện được sử dụng để biến tính cấu trúc glycoprotein đã được nghiên cứu lên hoạt tính chitinase. Việc bổ sung Tween 80 0,5%; Tween 20 1,0-2,0% và Triton X114 1,0% làm tăng hoạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tính chitinase lên tới 25%. Trong khi, những chất tẩy rửa còn lại ở các nồng độ khác làm giảm hoạt tính chitinase so với đối chứng. Đặc biệt, việc bổ sung SDS 0,5-1,5% làm giảm đến một phần ba hoạt tính và ở nồng độ cao hơn 2,0% hoạt tính chitinase bị ức chế hoàn toàn (Hình 3.10A).
Các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa thường sử dụng để biến tính protein và hòa tan các cơ chất kị nước trong phản ứng của enzyme. Chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80 và Triton X-114 được bổ sung vào phản ứng làm tăng hoạt tính chitinase của chủng nấm L. lecanii 43H trong nghiên cứu của chúng tôi.
Trong khi, Triton X-100 được Bhushan và Hoondal (1998) chứng minh có khả năng làm tăng hoạt tính của chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp. BG-11 [24].
Chitinase được sinh ra từ vi khuẩn B. licheniformis MB-2 có khả năng chống lại sự biến tính bởi urê, Tween 20 và Triton X100; nhưng không bền đối với dimethyl sulphoxide và polyethylene glycol [137]. Zeki và Muslim (2010) nhận thấy, việc bổ sung Triton X100 1,0% làm tăng hoạt tính chitinase từ vi khuẩn
S. marcescens đến 40%, trong khi chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H bị giảm
hoạt tính [148]. Như vậy, nghiên cứu về ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase của chúng tôi khác so với một số nghiên cứu đã công bố. Kết quả nghiên cứu này cho thấy, chitinase từ L. lecanii 43H có sức đề kháng cao với các chất tẩy rửa Tween 80, Tween 20 và Triton X114. Tính kháng với các chất tẩy rửa của chitinase có ý nghĩa rất lớn trong quá trình điều chế thuốc trừ sâu sinh học vì các chất tẩy rửa như Tween 80 hay được sử dụng để giúp bào tử khuếch tán đều trong dung dịch. Giả thuyết nghiên cứu này góp phần chứng minh quá trình phối trộn chitinase với bào tử nấm được pha với Tween 80 khi xử lý với rệp có ý nghĩa quan trọng góp phần nâng cao chất lượng của chế phẩm.
3.2.2.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính chitinase
Các dung môi hữu cơ đã được sử dụng cho việc hòa tan các chất kị nước trong phản ứng enzyme, do đó chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ khác nhau đối với enzyme. Việc bổ sung các dung môi hữu cơ methanol, acetone ở nồng độ từ 10-30% làm ức chế nhẹ hoạt tính chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H, hoạt tính chitinase duy trì từ 89-95%. Hoạt tính
chitinase giảm mạnh khi ủ chitinase với các dung môi hữu cơ isopropanol, ethanol và butanol ở nồng độ từ 10-30%, đặc biệt là n-butanol ở nồng độ 20% làm hoạt tính chỉ duy trì 37% so với đối chứng (Hình 3.10B).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A B
Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và chất tẩy rửa (B)
lên hoạt tính chitinase
CT: đối chứng; TW80: Tween 80; TW20: Tween 20; TX100: Triton X100; TX114: Triton X114
MeOH: Methanol; IsOH: Isopropanol; EtOH: Ethanol; Acet: Aceton; BtOH: Butanol
Zeki và Muslim (2010) nhận thấy, hoạt tính chitinase từ vi khuẩn
S. marcescens bị ức chế bởi methanol, ethanol và acetone, hoạt tính chitinase
duy trì lần lượt là 45; 68 và 44% [148]. Trong khi, hoạt chitinase từ chủng nấm
L. lecanii 43H trong nghiên cứu của chúng tôi bị giảm xuống khi bổ sung với các
dung môi khảo sát. Qua các công bố trên, có thể tạm thời khảng định chitinase từ các vi sinh vật có sức đề kháng kém với các dung môi hữu cơ được khảo sát.
3.2.2.6. Động học của phản ứng enzyme
Để đánh giá tính đặc hiệu của chitinase với cơ chất, hoạt tính chitinase được xác định với chitin huyền phù ở các nồng độ khác nhau, và mối quan hệ giữa 1/[S] và 1/V được thiết lập để tính giá trị Km và Vmax của enzyme này theo phương trình Lineweaver-Burk [82]. Giá trị Km và Vmax của chitinase tinh sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H lần lượt là 0,82 mg chitin huyền phù/ml và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Giá trị Km và Vmax đặc trưng cho tính đặc hiệu của một enzyme với một cơ chất, Km bé thì ái lực của enzyme với cơ chất lớn và ngược lại. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, giá trị Km (0,82 mg chitin huyền phù/ml) từ chủng nấm
L. lecanii 43H là thấp hơn so với chitinase từ chủng nấm G. catenulatum HL11
(2,832 mg/ml) [86] và từ vi khuẩn Enterobacter sp. NRG4 (1,41 mg/ml) [30],
nhưng cao hơn so với chitinase từ chủng nấm T. harzianum CECT 2413 (0,3 và 0,5 mg/ml) [32]. Giá trị Vmax (4,51 U/mg protein) của chitinase từ chủng nấm
L. lecanii 43H thấp hơn so với chitinase từ vi khuẩn Enterobacter sp. NRG4
(74,07 μmol/h/μg protein) và chủng nấm T. harziunum CECT 2413 (3,6 và 5,2
µg/min/mg) khi bổ sung chitin huyền phù làm nguồn cơ chất.
3.2.2.7. Sản phẩm của sự thủy phân enzyme với cơ chất
Sản phẩm chính của quá trình thủy phân chitin huyền phù bởi chitinase tinh sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H đã được xác định là N-acetyl glucosamine trên bản TLC (Hình 3.11).
Sản phẩm chính của quá trình thủy phân chitin huyền phù bởi chitinase tinh sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H đã được xác định là N-acetyl glucosamine trên bản TLC mà không có một oligomer nào của N-acetyl glucosamine. Trong khi đó, enzyme thủy phân chitin huyền phù từ vi khuẩn Aeromonas chủ yếu là
N,N-diacetyl-chitobiose và một lượng thấp hơn là các mono-, tri-, và tetramer- của N-acetyl glucosamine và enzyme này đã chỉ ra là một endochitinase [54]. Mặt khác, chitinase của chúng tôi thuộc nhóm II với khối lượng phân tử từ 32-33 kDa và theo nghiên cứu của Rocha-Pino và đồng tác giả (2011) [118], chitinase này có thể là một exochitinase. Như vậy, từ hai công bố trên chúng tôi có thể kết luận, chitinase từ nấm L. lecanii 43H là một exochitinase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm
thủy phân chitin bởi chitinase
Giếng 1: chitinase tinh sạch, giếng 2: sản phẩm thủy phân chitin huyền phù sau 96 h, giếng 3: chitin huyền phù 0,5%, giếng 4: N-acetyl glucosamine chuẩn.