4. Những đóng góp mới của luận án
3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P.pastoris X33
3.4.4.1. Xác định nhiệt độ và pH thích hợp của rChit
rChit từ nấm P. pastoris X33 hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ 20-65°C.
Hoạt tính chitinase tăng dần từ 15,79 U/mg protein ở 20°C đến tối đa 23,85 U/mg ở 40°C và giảm dần xuống 9,24 U/mg protein ở 65°C (Hình 3.22A). Ở dải pH khảo sát, rChit bị mất hoạt tính hoàn toàn ở pH 3,5-4,0. Hoạt tính chitinase tăng dần từ 12,53 U/mg protein ở pH 4,5 đến tối đa 18,78 U/mg protein ở pH 5,5 và giảm xuống đến 11,85 U/mg protein ở pH 8,0 (Hình 3.22B).
Hình 3.22. Nhiệt độ (A) và pH (B) thích hợp của rChit
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có phần khác so với những nghiên cứu trước đây, như chitinase của nấm L. psalliotae [42], T. virens UKM1 [16] và
nấm T. harzianum [26] có dải nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 35-40°C và
pH 4,0-6,0. Tuy nhiên, một vài chitinase khác như chitinase của nấm B. bassiana [39] và chitinase của nấm T. ressei [55] hoạt động tốt nhất ở dải nhiệt độ tối ưu là 50-55ºC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.4.4.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit
Hoạt tính rChit giảm không đáng kể ở 30 và 35°C sau 20 giờ ủ, hoạt tính duy trì trên 90%. Trong khi ở 40°C, hoạt tính rChit chỉ còn 40% (Hình 3.23A). Ở pH 6,0 hoạt tính rChit còn 80% sau16 giờ ủ. Trong khi, ở dải pH 7,0-8,0 hoạt tính rChit mất hoàn toàn sau 4 giờ ủ (Hình 3.23B). Như vậy, rChit bền ở dải nhiệt độ dưới 35°C và pH 6,0.
Giống như pH và nhiệt độ tối ưu, Al-Rashed và đồng tác giả (2010) nhận thấy, chitinase tái tổ hợp do gen từ nấm T. virens UKM1 mã hóa được biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33 bền ở dải nhiệt độ 30-35°C và dải pH 5,0-7,0;
hoạt tính duy trì hơn 70% so với hoạt tính ban đầu [16]. Tuy nhiên, chitinase từ nấm Glaciozyma antarctica PI12 bền ở dải pH 3,0-4.5 và hoạt tính duy trì ở dải nhiệt độ từ 5-25°C [113]. Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng, rChit bền ở pH trung tính và dải nhiệt độ từ 30-35°C.
A B
Hình 3.23. Độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của rChit
3.4.4.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA tới hoạt tính rChit
Mức độ ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA ở các nồng độ khác nhau đối với hoạt tính rChit từ nấm men P. pastoris X33 là khác nhau. Hoạt tính rChit
tăng lên khi bổ sung các ion Pb3+
, Co2+ ở nồng độ 5-15 mM; các ion Cu2+, Fe2+ ở nồng độ 5-10 mM và các ion K+
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tăng từ 1-21%. Trong khi, các ion này ở nồng độ còn lại làm giảm không đáng kể hoạt tính rChit. Đặc biệt, các ion Ag+
, Al3+, Hg2+ và EDTA ở cả 3 nồng độ khảo sát đều làm giảm hoạt tính rChit, hoạt tính giảm mạnh ở nồng độ 15 mM (hoạt tính chỉ còn 27%) (Bảng 3.6).
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các ion ở nồng độ khác có ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme là khác nhau. Hầu hết các ion ở nồng độ càng cao, hoạt tính của enzyme càng bị giảm. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này ion Mn2+
ở nồng độ 15 mM lại xúc tác hoạt tính rChit, cao hơn so với ở nồng độ 5 mM.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit Ion kim loại và
EDTA
% hoạt tính tƣơng đối của chitinase ở nồng độ
5 mM 10 mM 15 mM K+ 99,0 ± 0,2 99,0 ± 0,2 100,0 ± 0,2 Zn2+ 99,0 ± 2,7 99,0 ± 2,7 96,0 ± 0,4 Ni2+ 99,0 ± 1,9 99,0 ± 1,9 87,0 ± 2,1 Ca2+ 99,0 ± 2,0 99,0 ± 2,0 121,0 ± 9,0 Ba2+ 96,0 ± 0,9 96,0 ± 0,9 102,0 ± 3,1 Mg2+ 79,0 ± 5,0 73,0 ± 4,3 59,0 ± 4,4 Mn2+ 85,0 ± 3,1 101,0 ± 7,0 105,0 ± 1,9 Fe2+ 108,0 ± 1,2 101,0 ± 4,4 94,0 ± 0,1 Cu2+ 106,0 ± 0,6 111,0 ± 2,8 99,0 ± 0,9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Co2+ 114,0 ± 1,8 110,0 ± 5,1 110,0 ± 4,6 Pb3+ 112,0 ± 3,8 102,0 ± 3,2 105,0 ± 3,7 Ag+ 35,0 ± 1,7 27,0 ± 0,0 27,0 ± 0,0 Al3+ 87,0 ± 1,4 34,0 ± 0,4 37,0 ± 0,3 Hg2+ 89,0 ± 2,0 32,0 ± 1,1 27,0 ± 0,3 EDTA 77,0 ± 0,5 73,0 ± 1,5 65,0 ± 3,7 ĐC 100,0 ± 2,5
Nghiên cứu của Ramli và đồng tác giả (2011) cho thấy, chitinase tái tổ hợp từ chủng G. antarctica tăng hoạt tính khi bổ sung vào phản ứng các ion K+
, Mn2+ và Co2+ (hoạt tính tăng lên 20% so với đối chứng). Các ion Li+, Na+ và Mg2+ làm tăng hoạt tính của chitinase tái tổ hợp do gen từ vi khuẩn B. licheniformis MY75 biểu hiện ở vi khuẩn E. coli; trong khi các ion Mn2+, Cr3+, Zn2+, Ag+, Cu2+ và Fe3+ lại ức chế hoạt tính của enyme [146]. Tang và đồng tác giả (2012) nhận thấy, hoạt tính của chitinase tái tổ hợp do gen từ nấm T. asperellum biểu hiện
trong nấm men P. pastoris GS-tachi1-K giảm nhẹ khi bổ sung 0,05 mol/l các ion Ag+, Hg2+, Cu2+, Fe2+ [133].
Như vậy, các ion kim loại khác nhau, ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng khác nhau tới hoạt tính của chitinase tái tổ hợp từ mỗi loài vi sinh vật.
3.4.4.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ
Tất cả các dung môi hữu cơ ở các nồng độ khác nhau đều ảnh hưởng đến hoạt tính của rChit. Việc bổ sung acetone 10% làm tăng mạnh hoạt tính rChit lên đến 20%. Trong khi, bổ sung methanol, isopropanol, ethanol 10% và n-butanol 20% cho thấy một sự thay đổi nhỏ lên hoạt tính ban đầu. Đặc biệt, hoạt tính rChit chỉ còn lại 38-60% so với hoạt tính ban đầu khi rChit được xử lý với các dung môi hữu cơ ở nồng độ 30% (Hình 3.24A).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.4.4.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa
Một số chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80, Triton X100, Triton X114 hay SDS ảnh hưởng tới hoạt tính của rChit. Các chất tẩy rửa Tween 80; Tween 20 0,5-2,0% và Triton X114 0,5% làm tăng hoạt tính rChit so với đối chứng, cao nhất là Tween 80 1,0% làm tăng hoạt tính lên 13%. Trong khi, bổ sung Triton X100 0,5-2,0% và Triton X114 1,0-2,0% làm giảm nhẹ hoạt tính rChit so với đối chứng. Đặc biệt, khi bổ sung SDS 0,5-2,0%, hoạt tính rChit bị ức chế mạnh, hoạt tính duy trì từ 27-40% so với ban đầu (Hình 3.24B).
Các chất tẩy rửa gồm Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và Triton X-114 làm tăng hoạt tính của rChit trong nghiên cứu của này. Trong khi, Triton X-100 được Bhushan và Hoondal (1998) chứng minh có khả năng làm tăng hoạt tính của chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp. BG-11 [24]. Chitinase được tạo ra từ vi
khuẩn B. licheniformis MB-2 không bị biến tính khi xử lý với urê và giữ được hoạt tính khi bổ sung Tween 20, Triton X-100. Tuy nhiên, enzyme này bị mất hoạt tính khi bổ sung dimethyl sulphoxide và polyethylen glycol [137]. Tang và đồng tác giả (2012) nhận thấy, hoạt tính của chitinase tái tổ hợp do gen từ chủng nấm T. asperellum mã hóa được biểu hiện trong nấm men P. pastoris GS-tachi1- K giảm nhẹ khi bổ sung SDS 1,0% và 10mmol/l β-mercaptoethanol [133].
A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tính rChit
CT: đối chứng; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X100, TX114: Triton X114; MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: ethanol, Acet: acetone, BtOH: n-butanol
Như vậy, nghiên cứu về ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase tái tổ hợp của chúng tôi khác so với một số nghiên cứu đã công bố. Kết quả nghiên cứu này cho thấy, rChit có sức đề kháng cao với các chất tẩy rửa Tween 80, Tween 20, Triton X100 và Triton X114.
Khi so sánh ảnh hưởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính của chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H với rChit do gen Chit từ nấm L. lecanii 43H mã hóa
được biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33, chúng tôi nhận thấy cả hai loại enzyme này đều có sức đề kháng cao với Tween 80, Tween 20 và Triton X114. Tính kháng với một số chất tẩy rửa của 2 loại enzyme này là đặc tính quan trọng và góp phần nâng cao chất lượng của chế phẩm sinh học khi phối trộn enzyme với chất tẩy rửa và bào tử.
3.4.4.6. Động học của rChit
Để đánh giá tính đặc hiệu của rChit với cơ chất, hoạt tính rChit được xác định với chitin huyền phù ở các nồng độ khác nhau, và mối quan hệ giữa 1/[S] và 1/V được thiết lập để tính giá trị Km và Vmax của enzyme này theo phương trình Lineweaver-Burk [82]. Giá trị Km và Vmax của rChit tinh sạch từ nấm men P. pastoris X33 là 0,77 mg chitin huyền phù/ml và 1,33 U/mg protein.
Giá trị Km (0,77 mg/ml) là thấp hơn so với chitinase từ nấm
G. catenulatum HL11 (2,832 mg/ml) [86] và vi khuẩn Enterobacter sp. NRG4
(1,41 mg/ml) [30], nhưng cao hơn so với chitinase từ nấm T. harzianum CECT
2413 (0,3 và 0,5 mg/ml) [32]. Giá trị Vmax (1,33 U/mg protein) xác định cho rChit từ nấm men P. pastoris X33 thấp hơn so với chitinase từ vi khuẩn Enterobacter sp. NRG4 (74,07 μmol/h/μg protein) và nấm T. harziunum CECT 2413 (3,6 và 5,2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đặc biệt, khi so sánh giá trị Km và Vmax của rChit do gen Chit từ chủng
nấm L. lecanii 43H mã hóa được biểu hiện trong nấm men P.pastoris X33 với
exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H cũng thấy có sự khác nhau. Giá trị Km và Vmax của rChit đều thấp hơn so với exochitinase. Như vậy, giá trị Km và Vmax đặc trưng cho mỗi loại hoạt tính của mỗi loại enzyme.