4. Những đóng góp mới của luận án
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L.lecanii 43H
Để xác định khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H, 20 ml dịch
bào tử (2.108/ml) được phun lên 25 cá thể rệp đã được nuôi ổn định trên lá cải ở 25-30°C và độ ẩm 80-85%. Kết quả cho thấy, tỉ lệ rệp chết tăng lên từ ngày thứ 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(đạt khoảng 30%) sau khi phun bào tử nấm và cao nhất ở ngày thứ 7 (đạt khoảng 83%) (Hình 3.29).
Mỗi chủng nấm có độc lực khác nhau đối với từng loài rệp và trong từng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khác nhau. Độc lực của chủng nấm trong nghiên cứu này cao hơn so với các chủng nấm Lecanicillium trong nghiên cứu của Vu và
đồng tác giả (2007). Trong nghiên cứu này, khi phun dịch bào tử có nồng độ 1×107 bào tử/ml (không có khác biệt nhiều so với nồng độ 1×108 bào tử/ml) trong điều kiện nhiệt độ 25°C và độ ẩm không khí 75%, chủng có độc lực mạnh nhất là L. lecanii 41185 có khả năng diệt 50% rệp M. persicae và A. gossypii
trong 2 ngày. Chủng yếu nhất là L. fusisporum 4078 cũng diệt được 50% hai loại rệp trên trong 4 ngày [143]. Chủng L. lecanii CS-625 trong nghiên cứu của Kim và đồng tác giả (2001) diệt được 50% rệp A. gossypii sau 3 ngày ở 20°C [71].
Trong nghiên cứu của Kim và đồng tác giả (2008), chủng L. attenuatum
CNU-23 với nồng độ bào tử 108/ml diệt được 80% rệp M. persicae trong điều
kiện 25 ± 2°C và độ ẩm 85 ± 5% [68]. Các chủng Lecanicillium trong thí nghiệm của Vu và đồng tác giả (2007) diệt được 72-100% rệp sau 4-8 ngày phun ở 25°C và độ ẩm 75% [143]. Ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm này, các chủng nấm chúng tôi khảo sát có khả năng diệt rệp thấp hơn so với nghiên cứu của Vu và đồng tác giả (2007). Trong một nghiên cứu khác, chủng nấm L. lecanii CS-626 diệt được 98,2% bướm trắng trong nhà kính ở 25 C sau 7 ngày [79], chủng nấm
L. attenuatum CS625 diệt được 100% rệp sau 5 ngày [70].
Như vậy, chủng nấm chúng tôi khảo sát đều có khả năng diệt rệp hại rau cải. Tuy nhiên, so với các chủng nấm đã công bố trên thế giới thì chủng nấm của chúng tôi khảo sát có tỉ lệ rệp chết thấp hơn. Ở Việt Nam, các công bố về sử dụng chế phẩm bào tử nấm để diệt rệp còn rất hạn chế. Hướng nghiên cứu của các nhóm tác giả đã chứng minh tính hiệu quả trong chiến lược sử dụng chế phẩm bào tử nấm để diệt rệp nói riêng và côn trùng nói chung.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Dựa trên cơ chế gây bệnh của nấm trên côn trùng theo con đường chính là bào tử nảy mầm phát triển thành hệ sợi ăn sâu vào khoang bụng, qua đường tiêu hóa, thông qua các khí quản và chúng phủ kín các lỗ khí côn trùng làm chúng chết. Do vậy, hướng nghiên cứu về tốc độ phát triển sợi nấm, tỉ lệ nảy mầm của bào tử và các nghiên cứu về chitinase được tiến hành nghiên cứu góp phần chứng minh cho khả năng diệt rệp của bào tử nấm L. lecanii. Mặt khác, trong
quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được thời gian. Đặc điểm này đã gợi ý chúng tôi tiếp tục nghiên cứu phối trộn enzyme với bào tử nấm L. lecanii có thể được tiến hành trong thời gian tới nhằm nâng cao hơn
hiệu quả diệt rệp của chế phẩm bào tử nấm.
A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
E
Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và biểu đồ
thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H
A và B: Mẫu rệp trước khi phun; C: Mẫu nấm mọc trên rệp sau phun; D: hình ảnh nấm mọc trên quan sát trên kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần; E: Biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Chủng nấm L. lecanii
8 chủng nấm L. lecanii
ng định chủng này là L. lecanii và được đăng kí trong GenBank với mã số JX665044.
1.2. Exochitinase từ L. lecanii 43H tinh sạch được có khối lượng phân tử khoảng 33 kDa; hoạt tính riêng đạt 167,5 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 1,9%; độ sạch 2,5 lần. Enzyme này
kim loại, dung và chất tẩy rửa khảo sát có ảnh hưởng tới hoạt tính của exochitinase.
1.3. Gen Chit phân lập từ L. lecanii , xác định trình tự nucleotide và đăng kí trong GenBank với mã số JX665045.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thuộc họ glycosyl hydrolase 18 đã được biểu hiện thành công trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao.
rChit đã được tinh sạch có khối lượng phân tử ~45 kDa, hoạt tính riêng đạt 11,93 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 10%, độ sạch 1,8 lần. Enzyme này hoạt
động tốt dưới 35°C và pH 6,0. kim loại,
dung và chất tẩy rửa khảo sát có ảnh hưởng tới hoạt tính của rChit. 1.5. Exochitinase có khả năng ức chế sự phát triển của nấm F. oxysporum và R. solani; rChit làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp và bào tử nấm L. lecanii 43H
có khả năng diệt được rệp.
2. KIẾN NGHỊ
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính của phức hợp chitinase (exochitinase và endochitinase) và bào tử chủng nấm L. lecanii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1. Huu Quan Nguyen, Dinh Thi Quyen, Sy Le Thanh Nguyen, Van Hanh Vu (2015), “An extracellular antifungal chitinase from Lecanicillium lecanii:
purification, properties and application in biocontrol against plant pathogenic fungi”, Turkish Journal of Biology, 39, tr. 6-14.
2. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2014), “Cloning and expression of a gene encoding chitinase from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, In: the 3rd Academic conference on natural science for master and PhD students from Asean countries, tr. 438-445.
3. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi, Phạm Thị Huyền (2013), “Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ nấm Lecanicillium lecanii 43H”, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ,1, tr. 426-430.
4. Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Hữu Quân, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu độc tính của nấm kí sinh côn trùng trên rệp hại ngô Aphids maydis để sản xuất
thuốc trừ sâu sinh học”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, 50(3D), tr. 1009-1015.
5. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu độc tính và đặc tính sinh học của chủng nấm Lecanicillium đối với rệp đào”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 50(3D),
tr. 862-868.
6. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2012), « Biological characteristics and virulence of Lecanicillium lecanii strains against Chinese
cabbage aphids”, In: The 2nd Academic conference on Natural Science for Master and PhD Students from Cambodia-Laos-Malaysia, tr. 423-427.
1. Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain 43H
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2. Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain 43H chitinase gene, partial cds. GenBank: JX665045.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bùi Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Trường, Vũ Duy Thanh, Nguyễn Thị Kim Lý, Nguyễn Đức Doanh, Phan Tố Phượng, Nguyễn Hồng Minh, Lê Thị Ánh Hồng (2009), "Nghiên cứu chuyển gen Chitinase - Glucanase kháng nấm vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens", Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 1, tr. 2-7.
2. Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng (2003), "Khảo sát quá trình cảm ứng enzym chitinaza và celluloza của Trichoderma harzianum - Ảnh hưởng của hai enzym này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii", Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 321-324.
3. Đặng Trọng Lương, Kiều Thị Dung, Nguyễn Thúy Điệp, Phí Công Nguyên, Đặng Thị Minh Trang, Nguyễn Trường Khoa (2005), "Nghiên cứu chuyển gen chitinase kháng nấm vào cây lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaceins", Báo cáo khoa học, hội nghị toàn quốc, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 1295-1297.
4. Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Chikafusa Fukazawa (1999), "Tinh chế và xác định tính chất của chitinase từ đậu tương", Kỷ yếu
Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Tự nhiên Hà Nội,
tr. 585-591.
5. Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2007), "Khảo sát hoạt tính các enzym chitinase, β-glucanse, cellulase, pectinase, amylase, protease của các chủng Trichoderma phân lập tại Việt
Nam", Báo cáo khoa học, hội nghị toàn quốc, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 100-105.
6. Đinh Minh Hiệp, Phạm Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008), "Thu nhận chitinase từ chủng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghệ thực phẩm, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 48-51.
7. Hà Hồng Hạnh, Lê Thanh Hương, Lê Thị Thu Hiền (2013), "Phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các vector biểu hiện thực vật", Kỷ yếu Hội nghị
Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr.
82-86.
8. Nguyễn Ngọc Mai, Vũ Văn Hạnh (2013), "Nâng cao khả năng sản xuất chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng bằng kỹ thuật đột biến", Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 364-368.
9. Nguyễn Thị Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Mai, Vũ Văn Hạnh (2013), "Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium đột biến", Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 379-383.
10. Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2004), "Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng vi khuẩn đối kháng vi nấm", Báo cáo khoa học, hội nghị toàn quốc, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 125-128.
11. Quách Ngọc Tùng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Phương Nhuệ, Phí Quyết Tiến (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp chitinase của chủng Bacillus licheniformis DS23 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm", Tạp chí Khoa học và Công nghệ - VAST, 50, tr. 625-632.
12. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Bích Thủy, Đỗ Trung Sỹ (2008), "Động học của quá trình hoạt hóa chitinase trong phản ứng thủy phân chitin thành glucosamine", Tạp chí Khoa học và Công nghệ - VAST,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
13. Vũ Thị Thanh, Vũ Văn Hạnh, Nghiêm Ngọc Minh, Quyền Đình Thi (2013), "Tối ưu hóa các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp.M4 phân lập từ ruộng
mía", Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013, Nxb Khoa học
tự nhiên và Công nghệ, 1, tr. 484-488.
TIẾNG ANH
14. Abbott W. S. (1925), "A method of computing the effectiveness of an insecticide", J. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.
15. Abd Elhamid M. I., Makboul H. E., Sedik M. Z., Ismail I. M., Ibrahim M. A. (2010), "Cloning, expression and antifungal activity of an endochitinase gene derived from Barley (Hordeum Vulgare)", Res. J. Agric. Biol. Sci., 6,
pp. 356-363.
16. Al-Rashed S. A. A., Bakar F. D. A., Said M., Hassan O., Rabu A., Illias R. M., Murad A. M. A. (2010), "Expression and characterization of the recombinant Trichoderma virens endochitinase Cht2", Afr. J. Microbiol. Res., 4, pp. 1758-1767.
17. Altre J. A., Vandenberg J. D. (2001), "Factors influencing the infectivity of isolates of Paecilomyces fumosoreus against diamondback moth, Plutella
xylostella", J. Invertebr. Pathol., 78, pp. 31-36.
18. Altre J. A., Vandenberg J. D., Cantone F. A. (1999), "Pathogenicity of
Paecilomyces fumosoreus isolates to diamondback moth, Plutella
xylostella: correlation with spore size, germintation speed, and attachment to cuticle", J. Invertebr. Pathol., 73, pp. 332-338.
19. Annamalai N., Giji S., Arumugam M., Balasubramanian T. (2010), "Purification and characterization of chitinase from Micrococcus sp. AG84
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
20. Anuradha V., Revathi K. (2013), "Purification and characterization of chitinase fromtwo Bacillus sp isolated from crustacean shells", J. Microbiol. Biotech. Res., 3, pp. 160-167.
21. Balasubramanian N., Juliet A. A., Srikalavani P., Lalithakumari D. (2003), "Release and regeneration of protoplasts from Trichothecium roseum", Can. J. Microbiol., 49, pp. 263-268.
22. Barboza-Corona J. E., Nieto-Mazzocco E., Velázquez-Robledo R., Salcedo-Hernandez R., Bautista M., Jiménez B., Ibarra J. E. (2003), "Cloning, sequencing, and expression of the chitinase gene chiA74 from
Bacillus thuringiensis", Appl. Environ. Microbiol., 69, pp. 1023-1029.
23. Barghini P., Moscatelli D., Garzillo A. M. V., Crognale S., Fenice M. (2013), "High production of cold-tolerant chitinases on shrimp wastes in bench-top bioreactor by the Antarctic fungus Lecanicillium muscarium CCFEE 5003: Bioprocess optimization and characterization of two main enzymes", Enzyme Microb. Technol., 53, pp. 331-338.
24. Bhushan B., Hoondal G. S. (1998), "Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp. BG-11", Biotechnol Lett, 20, pp. 157–159.
25. Brzezinska M. S., Jankiewicz U. (2012), "Production of antifungal chitinase by Aspergillus niger LOCK 62 and its potential role in the
biological control", Curr. Microbiol., 65, pp. 666-72.
26. Caihong H., Qian Y., Jinzhu S., Yingqi S. (2007), "Expression of a novel chitinase gene from Trichoderma harzianum in Saccharomyces cerevisiae",
Proceedings of the 1 st International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering held at Wuhan, China 1, pp. 283-285.
27. Campbell N. A. (1996), "Biology (4th edition) Benjamin Cummings", New
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
28. Chen C. C., Kumar H. G. A., Kumar S., Tzean S. S., Yeh K. W. (2007), "Molecular cloning, characterization, and expression of a chitinase from the Entomopathogenic fungus Paecilomyces javanicus", Current Microbiology, 55, pp. 8-13.
29. Choi J. H., Lee S. Y. (2004), "Secretory and extracellular production of recombinant proteins using E. coli", Appl. Microbiol. Biotechnol., 64, pp.
625-635.
30. Dahiya N., Tewari R., Tiwari R. P., Hoondal G. S. (2005), "Chitinase from
Enterobacter sp. NRG4: Its purification, characterization and reaction
pattern", Electron. J. Biotechnol., 8, pp. 1-6.
31. Daniel M. B., Michael D. R., Stuart J. E. (1996), "Protein methods", New York: Wiley-Liss, pp. 91-95.
32. de la Cruz J., Hidalgo-Gallego A., Lora J. M., Benitez T., Pintor-Toro J. A., Llobell A. (1992), "Isolation and characterization of three chitinases from
Trichoderma harzianum", Eur. J. Biochem., 206, pp. 859-867.
33. di Pietro A., Lorito M., Hayes C. K., Broadway R. M., Harma G. E., Harma G. E. (1993), "Endochitinase from Gliocladium virens: Isolation,
characterization, and synergistic antifungal activity in combination with gliotoxin", Phytopathology, 83, pp. 303-313.
34. Diaz B. M., Oggerin M., Lopez Lastra C. C., Rubio V., Fereres A. (2009), "Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against different
aphid species", BioControl, 54, pp. 825-835.
35. Ding X., Gopalakrishnan B., Johnson L. B., White F. F., Wang X., Morgan T. D., Kramer K. J., Muthukrishnan S. (1998), "Insect resistance of transgenic tobacco expressing an insect chitinase gene", Transgenic. Res.,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
36. Duo C. L., Shu C., Jing L. U. (2005), "Purification and partial characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus
Talaromyces flavus", Mycopathologia, 159, pp. 223-229.
37. El-Katatny M. H., Somitsch W., Robra K. H., El-Katatny M. S., Gubitz G. M. (2005), "Production of chitinase and 1,3- gluanase by Trichoderma harzianum for control of the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii", Food Technol. Biotechnol., 38, pp. 137-180.
38. Elias J. A., Homer R. J., Hamid Q., Lee C. G. (2005), "Chitinases and chitinase-like proteins in TH2 inflammation and asthma", J. Allergy. Clin. Immunol., 116, pp. 497-500.
39. Fan Y., Zhang Y., Yang X., Pei X., Guo S., Pei Y. (2007), "Expression of a
Beauveria bassiana chitinase (Bbchit1) in Escherichia coli and Pichia