4. Những đóng góp mới của luận án
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L.lecanii 43H
Sản phẩm PCR từ DNA hệ gen của chủng nấm L. lecanii 43H thu được có
kích thước khoảng 1,4 kb. Sản phẩm PCR sau đó được gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJEChit và biến nạp vào vi khuẩn
E. coli DH5 . Plasmid tái tổ hợp pJEChit thu được có kích thước lớn hơn đối
chứng. Plasmid pJEChit được chọn lọc và cắt kiểm tra bằng enzyme EcoRI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel agarose 0,8% có 2 băng DNA kích thước
khoảng 3,0 kb tương ứng với vector pJET1.2/blunt và băng còn lại có kích thước khoảng 1,4 kb tương ứng với đoạn gen Chit (Hình 3.12).
Hình 3.12. Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen
Giếng M: marker, Giếng 1: sản phẩm PCR từ DNA, Giếng 2: pJET1.2/blunt, Giếng 3: pJEChit, Giếng 4: sản phẩm cắt pJEChit bằng EcoRI và XbaI.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Plasmid pJEChit đã được tách và tinh sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gen Chit từ DNA của chủng nấm L. lecanii 43H được xác
định trình tự có chiều dài 1429 nucleotide. Chủng nấm L. lecanii 43H là sinh vật nhân chuẩn và kết hợp với khảo sát các trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase của các nấm L. lecanii trên GenBank cho thấy gen mã hóa Chit từ
chủng nấm L. lecanii 43H có chứa 3 đoạn intron xen kẽ 4 đoạn exon. Kích thước của 4 đoạn exon lần lượt là 140, 99, 50 và 980 pb và 3 đoạn intron lần lượt là 57, 51 và 52 bp (Hình 3.13). Trình tự gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H được đăng kí trong GenBank với mã số JX665045.
Hình 3.14. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng
L. lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank
AY705927: L. lecanii DAOM 175104, DQ412944: L.lecanii 432, GU361767: Trichothecium roseum, KC904797: L. attenuatum CGMCC5328, KF041477: Cordyceps confragosa
Trình tự đoạn gen Chit từ DNA của chủng nấm L. lecanii 43H có độ tương
đồng 99,9% so với nấm V. lecanii (mã số GenBank là DQ412944.1) (Hình 3.14). Để loại bỏ các intron trước khi đưa vào vector biểu hiện, gen Chit được
khuếch đại sau phản ứng RT-PCR từ mRNA. RNA tổng số của chủng nấm
L. lecanii 43H sau khi tinh sạch được dùng làm khuôn thực hiện phản ứng
RT-PCR tạo cDNA. Sản phẩm PCR từ khuôn cDNA được điện di trên gel agarose, có kích thước ~1,3 kb đúng như lý thuyết. Sản phẩm PCR sau đó được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJEChit1 và biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5 . Plasmid pJEChit1 thu được có kích thước
lớn hơn đối chứng. Sản phẩm cắt pJEChit1 cho 2 băng tương ứng với cDNA gen
Chit (~1,3 kb) và pJET1.2/blunt (~3,0 kb) (Hình 3.15). Trình tự cDNA gen Chit
sau khi được giải trình tự có chiều dài 1269 nucleotide tổng đúng bằng kích thước của 3 đoạn exon từ gen DNA hệ gen.
Như vậy, cDNA gen Chit mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii dài 1269 nucleotide (bao gồm cả mã mở đầu và kết thúc), thuộc họ glycosyl hydrolase 18 thủy phân liên kết glycoside. Trình tự amino acid suy diễn dài 423 amino acid, trong đó 20 amino acid đầu N là peptide tín hiệu (phân tích bằng signal peptide SignalP-3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)). Theo phân tích lý thuyết, protein này có khối lượng phân tử khoảng 45 kDa, gồm 36 amino acid mang tính base mạnh, 41 amino acid có tính acid mạnh, 147 amino acid kị nước và 128 amino acid phân cực.
Hình 3.15. Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA
Giếng M: marker, giếng 1: sản phẩm PCR từ mRNA, giếng 2: pJET1.2/blunt, giếng 3: pJEChit1 mang gen Chit từ mRNA, giếng 4: sản phẩm cắt pJEChit1
Trình tự amino acid suy diễn của rChit có độ tương đồng 100% so với chitinase từ các nấm L. lecanii 432 (DQ412944), L. attenuatum CGMCC5328 (KC904797); 99,8% với chitinase từ nấm C. confragosa (KF041477) và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
69-91% với chitinase từ nấm L. lecanii DAOM 175104 (AY705927) và
T. roseum (GU361767) (Hình 3.16).
Hình 3.16. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit từ
L. lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank
AY705927: L. lecanii DAOM 175104, DQ412944: L.lecanii 432, GU361767:
Trichothecium roseum, KC904797: L. attenuatum CGMCC5328, KF041477: Cordyceps confragosa
3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của rChit trong nấm men P. pastoris X33
3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men
Plasmid pJEChit1 mang gen Chit và vector pPICZαA cùng được cắt bằng EcoRI và XbaI. Sau đó được nối với nhau bằng T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp
pPIChit1. Dịch lai được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α bằng sốc nhiệt.
Plasmid pPIChit có kích thước lớn hơn, nên nằm cao hơn so với pPICZαA (Hình 3.17A).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Plasmid pPIChit (1), plasmid pPICZαA (ĐC), sản phẩm cắt pPIChit với
EcoRI và XbaI (2), sản phẩm cắt pPIChit1 với PmeI (3), Marker 1kb (M)
Plasmid pPIChit1 tinh sạch được cắt bằng enzyme EcoRI và XbaI cho hai
băng là vector pPICZαA (~3,6 kb) và cDNA gen Chit (1269 bp) (Hình 3.17 B). Plasmid pPIChit1 được đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện trước khi biến nạp và biểu hiện ở nấm men P. pastoris X33. Kết quả đọc trình tự cho thấy cấu trúc của vector biểu hiện đúng khung đọc, cDNAgen Chit chèn vào đúng vị trí
mong muốn, đủ điều kiện để đưa vào biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33.
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris
3.4.2.1. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPChit
Để biểu hiện cDNA gen Chit, plasmid tái tổ hợp pPIChit1 được cắt mở
vòng bằng PmeI thu được 1 băng có kích thước ~5,0 kb (ứng với kích thước của vecor pPICZαA và cDNA gen Chit) (Hình 3.17C), sau đó được biến nạp vào
genome của nấm men P. pastoris X33 với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp
biểu hiện rChit hiệu quả, bền và ổn định đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris X33
Giếng ĐC: khuôn pPIChit, giếng 1-11: khuôn DNA từ các dòng tái tổ hợp, giếng 12: khuôn DNA của nấm men P. pastoris X33 gốc, giếng M: marker
Các dòng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường YPG bổ sung zeocin qua đêm, tách DNA, sau đó PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra. Một số khuẩn lạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(1-4, 6-11) (Hình 3.18) có kích thước tương ứng với cDNA gen Chit. Như vậy, có thể kết luận các dòng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp có chứa đoạn gen Chit.
3.4.2.2. Sàng lọc các dòng nấm men P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp
Sau khi biến nạp, 32 dòng tái tổ hợp được nuôi và xác định mức độ biểu hiện rChit. Bảng 3.3 nhận thấy, 29 dòng có hoạt tính chitinase và 3 dòng không có hoạt tính. Trong đó, dòng số 18 có hoạt tính chitinase cao nhất (0,636 U/ml). Dòng số 18 được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men P. pastoris X33/pPChit
tái tổ hợp Các dòng U/ml Các dòng U/ml S1 0,602 ± 0,0002 S17 0,000 ± 0,0000 S2 0,427 ± 0,0003 S18 0,636 ± 0,0002 S3 0,456 ± 0,0019 S19 0,255 ± 0,0003 S4 0,382 ± 0,0006 S20 0,323 ± 0,0002 S5 0,367 ± 0,0009 S21 0,274 ± 0,0004 S6 0,434 ± 0,0004 S22 0,309 ± 0,0002 S7 0,296 ± 0,0003 S23 0,274 ± 0,0003 S8 0,454 ± 0,0006 S24 0,368 ± 0,0014 S9 0,296 ± 0,0003 S25 0,268 ± 0,0004 S10 0,316 ± 0,0002 S26 0,000 ± 0,0000 S11 0,534 ± 0,0002 S27 0,265 ± 0,0001 S12 0,272 ± 0,0014 S28 0,258 ± 0,0002 S13 0,581 ± 0,0006 S29 0,253 ± 0,0004 S14 0,392 ± 0,0013 S30 0,336 ± 0,0003 S15 0,521 ± 0,0004 S31 0,326 ± 0,0005 S16 0,374 ± 0,0004 S32 0,000 ± 0,0000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.4.2.3. Lựa chọn môi trường biểu hiện
Để khảo sát môi trường biểu hiện rChit, dòng số 18 được nuôi trong các môi trường khác nhau (BMM, BMMY, YB+YNB, YP, MM và MMY). Hoạt tính biểu hiện rChit cao nhất trong môi trường YP, hoạt tính đạt 0,753 U/ml (Bảng 3.4). Môi trường YP được lựa chọn để biểu hiện rChit cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.4. Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau
Môi trƣờng OD600nm U/ml
BMM 4,21 0,605 BMMY 5,01 0,632 YP+YNB 5,44 0,446 YP 5,46 0,753 MM 4,09 0,254 MMY 5,78 0,506 3.4.2.4. Lựa chọn nồng độ methanol
Trong quá trình biểu hiện, methanol đóng vai trò cảm ứng promoter AOX1 kiểm soát quá trình sinh enzyme. Mức độ biểu hiện rChit tăng dần khi tiếp methanol từ nồng độ 0-2,5% và đạt cực đại ở nồng độ 1,5%, hoạt tính đạt 1,094 U/ml (Hình 3.19A). Điện di đồ hình ảnh protein tổng số biểu hiện tối ưu nồng độ methanol, băng 45 kDa ở nồng độ mathanol 1,5% rất đậm (Hình 3.19B).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ứng ở các nồng độ methanol khác nhau A. Hoạt tính rChit và động thái sinh trưởng
B. Điện di đồ kiểm tra protein trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, giếng 1-5 ứng với nồng độ methanol lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5
3.4.2.5. Lựa chọn thời gian nuôi biểu hiện
Khi nuôi cấy nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp, hoạt tính rChit cao nhất đạt 1,11 U/ml sau 96 giờ nuôi cấy và giảm dần ở 120 giờ (đạt 1,05 U/ml) (Hình 3.20A). Điện di đồ hình ảnh protein tổng số được biểu hiện theo thời gian nuôi cấy, băng 45 kDa đậm dần theo thời gian nuôi (Hình 3.20B).
Với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp có năng suất biểu hiện và hoạt tính enzyme cao hơn so với chủng tự nhiên nhằm định hướng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học, đồng thời thuận lợi hơn cho các nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của enzyme. Gen Chit mã hóa rChit từ chủng nấm L. lecanii 43H được biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33. rChit được biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính 1,11 U/ml, thời gian biểu hiện là 96 giờ, tiếp methanol 1,5%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A. Hoạt tính rChit và động thái sinh trưởng
B. Điện di đồ kiểm tra protein trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, Giếng 1; 2; 3; 4; 5 ứng với thời gian nuôi biểu hiện lần lượt là 24; 48; 72; 96 và 120 giờ
Theo nghiên cứu của một số tác giả trước như Hamsah (2009) đã tối ưu quá trình biểu hiện chitinase trong vi khuẩn E. coli bằng phương pháp lên men bề
mặt sử dụng chất cảm ứng là IPTG và lactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cảm ứng IPTG ở nồng độ 1,19 mM và lactose ở nồng độ 0,98%, hoạt tính chitinase tái tổ hợp được sinh ra cao gấp 13,2 lần so với ban đầu (hoạt tính đạt 0,513 U/ml) [50]. Gen mã hóa chitinase từ nấm Thermomyces lanuginosus cũng được biểu hiện trong nấm men S. cerevisia để nâng cao năng suất biểu hiện tạo
chitinase. Kết quả cho thấy, chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao khi môi trường bổ sung chitin huyền phù 0,2% sau 4 ngày nuôi [108]. Al-Rashed và đồng tác giả (2010) cũng đã biểu hiện endochitinase từ chủng
T. virens trong nấm men P. pastoris X33, hoạt tính chitinase được sinh ra tăng
đáng kể so với chủng tự nhiên. Môi trường BMMY được sử dụng để tối ưu tăng hoạt tính endochitinase tái tổ hợp khi bổ sung methanol 0,5% sau mỗi 24 giờ trong 120 giờ nuôi cấy [16]. Năm 2012, Tang và đồng tác giả đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ nấm T. asperellum trong nấm men P. pastoris GS-tachi1-K. Kết quả nghiên cứu đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho quá trình tạo chitinase tái tổ hợp gồm methanol 0,5%, ở pH 6,5 sau 180 giờ nuôi; hoạt tính chitinase tái tổ hợp đạt 17,93 U/ml và năng suất biểu hiện là 6,19 g/l [133].
Như vậy, hướng nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn phù hợp so với một số nghiên cứu trên. Cách tiếp cận khi biểu hiện gen đều xuất phát từ khâu lựa chọn hệ biểu hiện, sau đó tối ưu môi trường biểu hiện và đều đạt được mục đích là nâng cao năng suất biểu hiện so với chủng tự nhiên. Kết quả của các nghiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cứu đã chỉ ra được sự khác nhau giữa các đối tượng (nguồn vi sinh vật cung cấp gen, đặc tính của gen và hệ biểu hiện) dẫn tới năng suất biểu hiện là khác nhau.
Năng suất biểu hiện rChit (trong nghiên của chúng tôi) với chitinase tái tổ hợp do gen mã hóa được phân lập ở một số loài nấm có quan hệ gần như
L. psalliotae hay L. lecanii là khác nhau. Gan và đồng tác giả (2007) đã biểu
hiện thành công gen mã hóa chitinase từ nấm L. psalliotae trong nấm men P. pastoris GS115 sử dụng vector pPIC9K. Tuy nhiên, hoạt tính chitinase tái tổ
hợp thu được chỉ đạt 15 mU/ml [42]. Zhu và đồng tác giả (2008) biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii trong vi khuẩn E. coli sử dụng
vector pMAL-c2X. Chitinase tái tổ hợp được tạo ra có hoạt tính 53 mU/ml, sau khi cảm ứng 0,3 mM IPTG, trong 4 giờ ở 37°C [151]. Như vậy, hoạt tính rChit đạt được cao hơn nhiều lần so với công bố của Gan và đồng tác giả (2007), Zhu và đồng tác giả (2008). Hơn nữa, nấm men P. pastoris X33 là hệ thống biểu hiện tốt và an toàn hơn so với các hệ biểu hiện khác. Do đó, chủng nấm men
P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp được lựa chọn để biểu hiện, tinh sạch và đánh
giá tính chất của rChit.
3.4.3. Tinh sạch rChit
rChit từ nấm men P. pastoris X33 có hoạt tính 1,11 U/ml (hoạt tính riêng
đạt 11,21 U/mg protein). Dịch enzyme này được cô lại bằng cột Millipore 10 kDa có hoạt tính đạt 11,54 U/mg protein, độ sạch là 1 và hiệu suất thu hồi đạt 92%. Dịch enzyme sau khi cô lại được đưa lên cột DEAE-Sephadex A-50. rChit đã được tinh sạch với độ sạch 1,8 lần và hiệu suất thu hồi đạt 10%. rChit tinh sạch có hoạt tính 11,93 U/mg protein (Bảng 3.5) và chỉ ra một băng protein duy nhất trên bản gel nhuộm bằng AgNO3 0,1%, khối lượng phân tử của protein này khoảng 45 kDa (Hình 3.21). Như vậy, rChit từ nấm men P. pastoris X33 đã
được tinh sạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bước tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt tính tổng số (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg) Độ sạch (lần) Hiệu suất (%) Enzyme thô 4,95 55,5 11,21 1,0 100,0
Enzyme cô mẫu 4,41 50,9 11,54 1,0 92,0
DEAE -
Sephadex A50 0,27 5,4 19,93 1,8 10,0
Sử dụng chương trình NetOGlyC-3.1 cho thấy, trình tự đoạn gen Chit
không chứa vị trí O-glycosyl hóa. Do đó, theo tính toán lý thuyết kích thước của rChit từ trình tự amino acid suy diễn đạt khoảng 45 kDa. Khi tiến hành tinh sạch rChit qua cột Millipore 10 kDa và DEAE-Sephadex A-50, chúng tôi thu được phân tử protein có khối lượng khoảng 45 kDa đúng như dự đoán theo lý thuyết. rChit có hoạt tính riêng đạt 19,93 U/mg protein và được xếp vào nhóm III (có MW từ 40-50 kDa).
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33
Giếng 1: dịch nổi, giếng 2: dịch lên cột DEAE-Sephadex A50, giếng 3-9: ứng với các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A50 có hoạt tính chitinase lần lượt là 11-14, 16-18. giếng M: marker.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thông thường, các enzyme tái tổ hợp được gắn thêm đuôi 6x histidine để thuận tiện trong tinh sạch và nâng cao hiệu quả tinh sạch. Các enzyme tái tổ hợp này thường sử dụng cột ProbondTM
resin để tinh sạch.
Nghiên cứu của Ramli và đồng tác giả (2011) đã sử dụng cột HisTrapTM HP để tinh sạch chitinase tái tổ hợp từ nấm men P. pastoris GS115 thu được enzyme