4. Những đóng góp mới của luận án
1.3. Ứng dụng của nấm L.lecanii và chitinase
, nông nghiệp, bảo vệ môi trường và trong công nghệ sinh học.
1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trƣờng
Trong nông nghiệp, để khắc phục hạn chế của thuốc trừ sâu hóa học trong quá trình kiểm soát dịch hại cây trồng bằng việc áp dụng các tác nhân sinh học đang trở thành một trong những hướng phát triển hiện nay.
1.3.1.1. Vai trò sinh lý của chitinase
Chitinase có ở các sinh vật chứa chitin (côn trùng, giáp xác, nấm) và không chứa chitin (vi khuẩn, thực vật bậc cao và động vật có xương sống). Ở động vật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chân đốt, chitinase liên quan đến quá trình lột xác và tiêu hóa chitin. Quá trình lột xác này được điều hòa bởi sự tổng hợp chitinase trong dịch lột xác đã tích lũy ở giữa lớp biểu bì cũ và lớp thượng bì. Sản phẩm của quá trình thủy phân được tái chế để tổng hợp các lớp biểu bì mới. Chitinase được tìm thấy trong ruột ấu trùng có chức năng tiêu hóa và phá vỡ chitin trong niêm mạc ruột [76].
Một số nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của chitinase và quá trình tổng hợp chitin xuất phát từ mối quan hệ của hai hoạt động trong quá trình bào tử nảy mầm của nấm Mucor mucedo [46], trong sự tăng trưởng theo cấp số nhân ở nấm
Mucor rouxii và Candida albicans [115]. Sahai và đồng tác giả (1993) nhận
thấy, chitinase xuất hiện trong quá trình trương của bào tử, sự nảy mầm bào tử, vào quá trình hình thành bào tử nang và đáp ứng với sự tổn thương cơ học ở
Choanephora cucurbitarum và 4 chi nấm tiếp hợp khác.
Quá trình tự động ly giải thể quả trưởng thành ra khỏi cơ thể nấm Copronus
lagopus được thực hiện dưới tác động của chitinase trước khi giải phóng bào tử.
Chitinase hoạt động kết hợp với các enzyme khác ở trong các khoảng gian bào của tế bào. Enzyme này được giải phóng ngẫu nhiên trong thành tế bào khi hoạt động trao đổi chất không diễn ra ở những tế bào già. Chitinase liên quan tới sự tự phân vùng tiếp giáp thành tế bào của nấm Neurospora crassa và Aspergillus nidulans [119]. Những căn cứ trên cho thấy, chitinase liên quan tới sự phân
nhánh của sợi nấm nhiều hơn sự tự phân hủy. Như vậy, chitinase ở nấm liên quan tới quá trình phát triển sợi nấm, trương phồng và nảy mầm của bào tử, quá trình giải phóng bào tử, sự phân tách và nảy chồi của tế bào.
Việc nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học, động học enzyme và tính chất diệt khuẩn của chitinase đã thúc đẩy quá trình bảo vệ cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh như nấm và côn trùng.
1.3.1.2. Nghiên cứu chế phẩm bào tử nấm trong kiểm soát côn trùng
Lecanicillium là chi nấm có khả năng kí sinh tự nhiên trên nhiều loài côn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dụng của nấm Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã
được sản xuất và thương mại hóa. Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử dụng chế phẩm sinh học diệt côn trùng còn hạn chế. Năm 2004, giá trị thương mại của chế phẩm sinh học diệt côn trùng được sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng [65]. Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển các chế phẩm diệt côn trùng từ nấm
Lecanicillium là cần thiết.
Năm 2007, Vu và đồng tác giả nghiên cứu sử dụng chủng nấm
Lecanicillium spp. để kiểm soát rệp M. persicae và Aphis gossypii. Trong điều
kiện phòng thí nghiệm, 100% rệp M. persicae và A. gossypii đã bị diệt sau
4-5 ngày phun. Trong nhà kính, rệp A. gossypii đã bị diệt 78% sau 14 ngày phun [143]. Trong một nghiên cứu khác, Kim và đồng tác giả (2008) đã sử dụng chủng nấm L. attenuatum CNU-23 để kiểm soát rệp M. persicae. Trong phòng
thí nghiệm, chủng nấm L. attenuatum CNU-23 diệt được 50% rệp sau 3 ngày
phun và 80% sau 7 ngày phun. Khi thử nghiệm trên cây ớt được trồng trong nhà kính, chủng nấm này diệt được 72-97% rệp sau 12 ngày phun [68]. Năm 2009, Diaz và đồng tác giả đã khảo sát độc lực của chủng nấm L. lecanii đối với một số loài rệp. Kết quả là chủng này diệt được 95% rệp M. persicae, trong khi sản
phẩm thương mại Vertalec® chỉ diệt được 91,6% [34].
Có nhiều sản phẩm diệt côn trùng có nguồn gốc từ nấm Lecanicillium đã
được thương mại hóa như Vertalec, Verelac, Mycotal, Enverto. Liều sử dụng của các sản phẩm trên là 250 ml chế phẩm (nồng độ bào tử là 2×108
CFU/ml) cho 4000 m2 cây trồng làm côn trùng chết sau 5-7 ngày phun. Các chế phẩm này không chỉ có tác dụng lên rệp mà còn tác dụng lên nhiều loại côn trùng khác như ruồi trắng, bọ trĩ, ve bét.
Mặc dù tiềm năng kiểm soát các côn trùng gây hại cây trồng của nấm
Lecanicillium rất lớn, nhưng việc nghiên cứu ứng dụng nấm Lecanicillium để
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hiệu quả diệt côn trùng của chế phẩm nấm Lecanicillium cũng như các chế phẩm sinh học khác còn kém, khối lượng chế phẩm sinh học diệt côn trùng được sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng. Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết.
1.3.1.3. Chitinase sử dụng trong quá trình kiểm soát côn trùng
Nấm kí sinh côn trùng có khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ của côn trùng bằng cách sản xuất ra nhiều enzyme ngoại bào nhằm phân giải protein và chitin tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập vào lớp biểu bì và gây nhiễm trùng [127], [128]. Ở tuyến trùng Brugia malayi sử dụng chitinase để phá vỡ lớp vỏ chitin bảo vệ và lớp niêm mạc để xâm nhập vào cơ thể muỗi kí sinh.
Baculoviruses chứa các gen mã hóa cho chitinase, tuy nhiên vai trò của chitinase
trong quá trình xâm nhập của cơ thể chủ chưa thể hiện rõ. Các enzyme thủy phân được côn trùng, nấm và các sinh vật khác sử dụng để lột xác hoặc xâm nhập có tiềm lực hữu ích trong quản lý dịch hại vì chúng có đặc tính phá hủy cấu trúc quan trọng như bộ xương ngoài hoặc niêm mạc của côn trùng.
Chitinase được sử dụng để pha trộn trong thí nghiệm nhằm tăng hiệu lực của vi nấm kí sinh côn trùng. Chitinase từ vi khuẩn B. thuringiensis và Baculovirus được sử dụng để tăng cường hoạt tính của thuốc trừ sâu vi sinh vật.
Ấu trùng của sâu chồi cây Chi vân sam và Choristoneura firmiferanu chết nhanh hơn khi tiếp xúc với hỗn hợp chitinse-Bacillus so với khi tiếp xúc với enzyme hoặc Bacillus riêng lẻ. Nghiên cứu của Shapiro và đồng tác giả (1987) cho thấy, ấu trùng bướm Gypsy khi sử dụng chitinase kết hợp với B. thuringiensis chết cao hơn so với sử dụng vi khuẩn riêng lẻ và tỉ lệ chết tăng tuyến tính khi tăng nồng độ chitinase.
Chitinase xuất hiện để nấm kí sinh côn trùng xâm nhập vào lớp biểu bì của cơ thể chủ. Trong trường hợp này, chitinase và N-acetyl glucosaminidase được tiết ra khi nấm kí sinh côn trùng (L. lecanii, M. anisopliae, B. bassiana) phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
triển trên lớp vỏ côn trùng. Độc tính của các chủng này tại thời điểm xâm nhập khi có chitinase cao hơn so với không bổ sung chitinase.
1.3.1.4. Chitinase sử dụng trong quá trình kiểm soát nấm hại cây trồng
Thuốc trừ sâu sinh học chống lại một số nấm bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp chitinase. Vi khuẩn tạo ra chitinase hoặc glucanase thể hiện sự đối kháng với nấm trong nuôi cấy invitro. Chitinase từ thực vật ức chế sự tăng trưởng sợi nấm và từ xạ khuẩn Streptomyces phân giải thành tế bào nấm. Vai trò của chitinase còn được chứng minh khi gây đột biến gen mã hóa chitinase của vi khuẩn S. marcescens làm mất khả năng kiểm soát sinh học của chitinase. Gen
này được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli giúp vi khuẩn E. coli giảm được tỉ lệ
mắc bệnh do nấm Sclerotium rolfsii và R. solani gây ra. Nghiên cứu của
Sundhemi (1990) chứng minh rằng, gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn
S. marcescens được biểu hiện trong vi khuẩn Pseudomonas sp. giúp cho chủng
này có khả năng chống lại nấm bệnh F. oxysporum và Gauemannomyces graminis [129].
1.3.2. Trong lĩnh vực y học
Trong lĩnh vực y học, chitinase tham gia vào quá trình miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu được. Chitinase cần thiết cho các chức năng khác nhau như: chitinase được biểu hiện trong suốt quá trình phát triển của cơ thể nhằm hỗ trợ việc tái tạo sinh học của cơ thể để thích ứng với những thay đổi về kích thước và hình dạng cơ thể. Ở một số cơ thể, chitinase tham gia vào tiêu hóa thức ăn có chứa chitin. Chitinase biểu hiện trong động vật có vú (người và chuột) gây ra một số phản ứng với tác nhân gây bệnh có chứa chitin (nấm, kí sinh trùng) và làm suy giảm hệ thống chitin trên các vi sinh vật gây nhiễm [38], [104].
Ở động vật có vú, khi bị mầm bệnh ngoại sinh có chứa cấu trúc chitin tấn công thì các chitinase sẽ xuất hiện để chống lại các mầm bệnh bảo vệ cơ thể. Các chitinase này bao gồm: chitinase thật và 1 loại protein chitinase phụ thuộc vào hoạt tính của nó (CLPs). Dạng chitinase thật gồm chitinase acid (AMCase) và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chitinase 1, đây là các chitinase động vật đầu tiên được nghiên cứu. Dạng CLPs gồm chitinase 31, chitinase 32 và một vài dạng khác. Hoạt tính của AMCase và chitinase 1 tham gia vào phân hủy chitin và tiêu diệt tác nhân gây bệnh. Các CLPs có vai trò sinh học quan trọng bằng cách liên kết ái lực cao với chitin. Chúng có chức năng trong quá trình nhận dạng phân tử các tác nhân gây bệnh có chứa chitin, bằng cách phát tín hiệu đến hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ để gắn kết với tác nhân gây bệnh và tiêu diệt. Ngoài ra, chitinase 31 giúp tăng cường đáng kể độ bám dính và sự xâm lược của các vi khuẩn gây bệnh vào trong lớp biểu bì ruột, bằng cách tương tác với chitin/phức hợp protein-chitin trên vi khuẩn [94].
Chitinase 1 hoạt động tích cực nhất trong các đại thực bào và bạch cầu trung tính, còn AMCase hoạt động chủ yếu trong các đại thực bào, các tế bào biểu mô và trong phổi. Sutherland (2009) nhận thấy, sản phẩm của chitinase và CLPs được điều chỉnh tăng lên trong 2 loại tế bào lympho T liên quan tới phản ứng viêm (như hen phế quản, viêm mũi, dị ứng gây bởi viêm) [130]. Chitinase 1 được chứng minh là một dấu hiệu cho bệnh Gaucher, xơ vữa động mạch, bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu và viêm khớp tự phát ở trẻ vị thành niên. Chitinase 31 chủ yếu điều chỉnh tăng lên trong bệnh viêm ruột, xơ gan, thấp khớp và bệnh ung thư. Như vậy, cả chitinase và CLPs được điều chỉnh tăng lên cao trong điều kiện viêm cấp tính hoặc mạn tính [59].
1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học
Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chitinase được ứng dụng để tạo tế bào trần, sản xuất các protein đơn bào và tham gia vào quá trình tạo các oligosaccharide.
Tế bào trần có vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu về nấm, cũng như chương trình cải biến các chủng nấm nhằm ứng dụng trong Công nghệ Sinh học. Năm 1970, Itan và Matile nhận thấy tế bào trần được tạo ra khi cuống bào tử được ủ trong dung dịch enzyme và hoạt tính thủy phân chủ yếu được thực
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hiện do chitinase được hình thành ngay trước khi giải phóng bào tử. Chitinase thương mại được sử dụng cho việc tạo tế bào trần từ sợi nấm rất có hiệu quả [56]. Luciana và đồng tác giả (2009) đã sử dụng chitinase tinh sạch từ chủng nấm C. cellulans191 để thủy phân sợi nấm Rhizopus oligosporus và Penicillium sp., kết quả thu được các tế bào trần sau 2 giờ ủ [85]. Pe’er và Chet (1990) [107], Tschen và Li (1994) [138], Balasubramanian và đồng tác giả (2003) [21] đã tạo được tế bào trần khi sử dụng chế phẩm thương mại Novozym 234 (gồm chitinase, cellulase và pectinase).
Để sử dụng hiệu quả lượng chất thải chitin, Revah và đồng tác giả (1981) đã đưa ra ý tưởng chuyển hóa sinh học chúng cùng với tế bào nấm men để tạo ra các protein đơn bào. Chitinase từ vi khuẩn S. marcascens đã được sử dụng cho sự chuyển hóa sinh học chitin thành các đường amin (chủ yếu là N-acetyl glucosamine) sử dụng cho sự phát triển của tế bào nấm men Pichia kudriavzevii. Quá trình này đã tạo ra được các protein đơn bào chiếm tỉ lệ 45% và lượng acid nucleic giảm xuống đáng kể (duy trì 8-11%) [117].
1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase 1.4.1. Trên thế giới 1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới, gen mã hóa chitinase trên đối tượng vi sinh vật đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Zhu và đồng tác giả (2008) đã phân lập được gen mã hóa endochitinase từ nấm L. lecanii. Gen từ mARN dài 1272 bp mã hóa phân tử
protein gồm 223 amino acid có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa [151]. Trên chủng nấm L. psalliotae, Gan và đồng tác giả (2007) đã phân lập được gen mã
hóa chitinase từ mRNA dài 1272 bp mã hóa cho phân tử protein dài 423 amino acid, có khối lượng phân tử khoảng 46 kDa [42].
Nghiên cứu trên nấm B. bassiana cho thấy, gen mã hóa chitinase từ DNA
dài 1047 bp, không chứa intron và mã hóa cho phân tử protein dài 348 amino acid. Phân tử protein tạo thành có kích thước khoảng 36 kDa [126]. Al-Rashed và đồng tác giả (2010) đã phân lập được gen mã hóa endochitinase từ mRNA dài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
966 bp mã hóa cho phân tử protein gồm 321 amino acid, có kích thước 35 kDa [16]. Từ nấm Paecilomyces javanicus, Chen và đồng tác giả (2007) đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ DNA có chiều dài 1035 bp, không chứa intron, mã hóa cho phân tử protein gồm 344 amino acid với khối lượng 37 kDa [28]. Ramli và đồng tác giả (2011) đã phân lập được gen mã hóa chitinase từ mRNA của chủng nấm Glaciozyma antarctica PI12. Gen dài 1215 bp, mã hóa cho phân tử
protein gồm 403 amino acid với khối lượng 39 kDa [113].
Như vậy, gen mã hóa chitinase từ một số chủng nấm là khác nhau về số lượng, kích thước và trình tự sắp xếp của các nucleotide. Chitinase tái tổ hợp được tạo ra bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp mang đến một số thuận tiện trong quá trình sản xuất và tinh sạch. Hơn nữa, chitinase tái tổ hợp còn có thể có một số tính chất thay đổi theo hướng có lợi so với enzyme tự nhiên. Bên cạnh đó, việc sử dụng các hệ biểu hiện để tạo enzyme tái tổ hợp cũng rất quan trọng cho sự phát triển các enzyme mới và sản xuất lượng lớn các enzyme này. Gen mã hóa chitinase đã được nhiều tác giả nghiên cứu biểu hiện ở các hệ thống biểu hiện khác nhau.
1.4.1.1. Biểu hiện chitinase trong vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, thuận tiện cho các thao tác
sinh học phân tử nên được lựa chọn là hệ biểu hiện phổ biến dùng cho những mục đích khác nhau. Trong đó, gen mã hóa chitinase đã được tách từ các đối tượng sinh vật khác nhau và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli để tạo ra lượng lớn
phục vụ cho nhiều lĩnh vực.
Barboza-Corona và đồng tác giả (2003) đã nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa endochitinase từ vi khuẩn B. thuringiensis trong vi khuẩn E. coli DH5α.
Phân tử protein được tạo ra gồm 676 amino acid, có khối lượng 74 kDa. Nhiệt độ và pH tối ưu của chitinase tái tổ hợp lần lượt là 57,2°C và pH 6,0 [22].
Bên cạnh sự biểu hiện gen mã hóa chitinase ở các sinh vật nhân sơ trong vi khuẩn E. coli, nhiều gen mã hóa chitinase ở các nhóm Eucaryote cũng được biểu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hiện trong vi khuẩn E. coli với mục đích nghiên cứu khả năng biểu hiện của
chúng. Songjang và đồng tác giả (2006) đã phân lập gen mã hóa chitinase từ