4. Những đóng góp mới của luận án
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và
từ nấm L. lecanii
3.5.1. Ảnh hƣởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani. Đường kính vòng ức chế của 2 chủng nấm này lần lượt là 0,54 và 0,44 cm, trong khi ở giếng đối chứng (bổ sung nước) không xuất hiện vòng ức chế (Hình 3.25).
Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 160× cho thấy, sự ức chế quá trình phát triển sợi nấm bởi chitinase đi kèm với sự thủy phân sợi nấm và giải phóng các tế bào riêng lẻ, trong khi sợi nấm được xử lý với nước vẫn duy trì hình dạng (Hình 3.26). Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng khi xử lý nấm bệnh F. oxysporum và R. solani với chitinase được xác định lần lượt là
11,07 và 9,18 μg/ml.
Năm 1993, Mathivanan và đồng tác giả đã chứng minh chitinase tinh sạch từ nấm F. chlamydosporum có khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử của nấm Puccinia arachidis và có khả năng thủy phân thành tế bào của bào tử và ống
mầm nấm này [87]. Endochitinase từ nấm Trichoderma được El-Katatny và đồng tác giả (2005) chứng minh có hoạt tính chống lại nấm Sclerotium rolfsii
[37]. Nghiên cứu của Ma và đồng tác giả (2012) chứng minh, chitinase từ chủng nấm G. catenulatum HL-1-1 ức chế sự phát triển sợi nấm, quá trình nảy mầm
bào tử và hạch nấm của 10 chủng nấm F. oxysporum và R. solani [86]. Chitinase từ vi khuẩn S. marcescens MO-1 có hoạt tính cao và có khả năng ức chế sự phát triển của một số loài nấm như A. niger, Rhizopus oryzae, F. oxysporum,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ T. harzianum và Alternaria citri được Okay và đồng tác giả chứng minh năm
2013 [99]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng chitinase từ chủng nấm
L. lecanii 43H để ức chế sự phát triển sợi nấm F. oxysporum và R. solani đã thu
được kết quả khả quan với đường kính vòng ức chế của 2 chủng nấm này lần lượt là 0,54 và 0,44 cm. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp so với các công bố trên và củng cố thêm quan điểm rằng chitinase có khả năng ức chế sự phát triển của các loài nấm bệnh. Đồng thời, kết quả nghiên cứu này cung cấp một cách tiếp cận thân thiện với môi trường để tạo ra chế phẩm sinh học chống lại nấm bệnh và là hướng nghiên cứu đang được quan tâm ở Việt Nam.
Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum (A) và R. solani (B)
bởi chitinase tự nhiên. Giếng 1: nước, giếng 2-5: chitinase
B B D C A A B C D A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani (A, B) và F. oxysporum (C, D) được xử lý với
nước (A, C) và với chitinase tự nhiên (B, D)
3.5.2. Ảnh hƣởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp
rChit từ nấm men P. pastoris X33 có khả năng thủy phân lớp vỏ chitin của rệp. Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng khi xử lý rệp với chitinase được xác định là 32,5 μg/ml. Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 160 lần cho thấy, sự thủy phân lớp vỏ chitin của rệp bởi chitinase đi kèm với sự giải phóng các khối chitin riêng lẻ, trong khi rệp được xử lý với nước vẫn duy trì hình dạng của lớp vỏ chitin (Hình 3.27).
A B
Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước (A)
và rChit từ nấm men P. pastoris X33 (B) (phóng đại 160 lần)
Gan và đồng tác giả (2007) đã chứng minh vai trò của chitinase tái tổ hợp do gen từ nấm L. psalliotae mã hóa được biểu hiện trong nấm men P. pastoris
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
làm xáo trộn sự phát triển trứng của tuyến trùng và làm suy thoái trứng của cá thể trưởng thành [42]. Chitinase được sử dụng khi phối trộn với bào tử làm tăng chất lượng của chế phẩm nấm kí sinh côn trùng. Ấu trùng của bướm Chi vân sam và Choristoneura firmiferanu chết nhanh hơn khi tiếp xúc với hỗn hợp
chitinase-Bacillus so với tiếp xúc với enzyme hoặc Bacillus riêng lẻ. Như vậy,
rChit do gen Chit từ nấm L. lecanii 43H biểu hiện trong nấm men P. pastoris
X33 mã hóa được coi là tác nhân có khả năng chống lại rệp. Kết quả nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của chitinase sử dụng trong quá trình diệt côn trùng và mở ra hướng nghiên cứu mới giúp tìm hiểu cơ chế trong quá trình diệt rệp của nấm L. lecanii và cách phối trộn enzyme với chế phẩm bào tử nấm.
3.5.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới tốc độ phát triển sợi nấm của đa số các loài nấm. Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy, ở 25°C chủng nấm L. lecanii 43H cho
đường kính phát triển sợi nấm đạt 12,8 mm/ngày cao hơn so với ở nhiệt độ 30°C (đường kính đạt 7,22 mm/ngày). Như vậy, tốc độ phát triển sợi nấm của chủng nấm L. lecanii 43H phụ thuộc đáng kể vào nhiệt độ và thích hợp ở dải nhiệt độ dưới 30°C.
Kết quả này cho thấy, sợi nấm L. lecanii 43H có tốc độ phát triển cao hơn
so với một số nghiên đã công bố trên thế giới như chủng nấm L. lecanii CS625,
L. lecanii 4078 và L. lecanii Btab01 có tốc độ phát triển sợi nấm ở 25°C lần lượt
là 3,67; 2,28 và 2,24 mm/ngày [69], [102]. Ở 28 C, tốc độ phát triển sợi nấm của các chủng B. bassiana là 1,66 mm/ngày [96].
3.5.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
Tốc độ phát triển và tỉ lệ nảy mầm của bào tử cao thể hiện tính hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm bào tử nấm trong quá trình diệt côn trùng và là cơ sở cho việc xác định tính khả thi của chủng nấm nghiên cứu. Do đó, khả năng nảy mầm của bào tử nấm L. lecanii 43H đã được chúng tôi nghiên cứu. Kết quả cho thấy, chủng nấm L. lecanii 43H cho tỉ lệ bào tử nảy mầm cao nhất ở nhiệt độ 25°C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(đạt khoảng 92%) sau 12 giờ ủ. Sau 24 giờ ủ ở cả 3 nhiệt độ khảo sát, hầu hết bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H đều nảy mầm, tỉ lệ đạt 98% (Hình 3.28).
Theo một số nghiên cứu trước đây cho thấy, tỉ lệ bào tử nẩy mầm của chủng nấm L. lecanii CS625 lần lượt là 95,5 và 98,4% ở 25 C sau khi ủ ở 12 và 24 giờ. Nhiệt độ tối ưu cho bào tử nẩy mầm và đường kính phát triển sợi nấm của chủng
L. lecanii CS625 dao động từ 20-25°C [48]. Tốc độ nẩy mầm của bào tử và khả
năng đâm xuyên của sợi nấm là nhân tố quan trọng trong quá trình tiêu diệt vật chủ của nấm [17], [18]. Vu và đồng tác giả (2007) nghiên cứu tỉ lệ nẩy mầm của nấm L. lecanii ở các nhiệt độ 10, 15, 20, 25, 30 và 35 C cho thấy, tỉ lệ nẩy mầm của những chủng nấm này đạt 100% ở 20-30 C sau 24 giờ ủ. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho bào tử nẩy mầm dao động từ 25-30 C. Ở nhiệt độ 10 và 35 C, bào tử của các chủng nấm này không nẩy mầm. Như vậy, khả năng nẩy mầm của chủng nấm L. lecanii 43H chúng tôi khảo sát thích hợp ở dải nhiệt độ 25-30°C sau 24 giờ ủ cho tỉ lệ nảy mầm cao và phù hợp với các nghiên cứu đã công bố.
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của
bào tử nấm L. lecanii 43H
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H
Để xác định khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H, 20 ml dịch
bào tử (2.108/ml) được phun lên 25 cá thể rệp đã được nuôi ổn định trên lá cải ở 25-30°C và độ ẩm 80-85%. Kết quả cho thấy, tỉ lệ rệp chết tăng lên từ ngày thứ 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(đạt khoảng 30%) sau khi phun bào tử nấm và cao nhất ở ngày thứ 7 (đạt khoảng 83%) (Hình 3.29).
Mỗi chủng nấm có độc lực khác nhau đối với từng loài rệp và trong từng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khác nhau. Độc lực của chủng nấm trong nghiên cứu này cao hơn so với các chủng nấm Lecanicillium trong nghiên cứu của Vu và
đồng tác giả (2007). Trong nghiên cứu này, khi phun dịch bào tử có nồng độ 1×107 bào tử/ml (không có khác biệt nhiều so với nồng độ 1×108 bào tử/ml) trong điều kiện nhiệt độ 25°C và độ ẩm không khí 75%, chủng có độc lực mạnh nhất là L. lecanii 41185 có khả năng diệt 50% rệp M. persicae và A. gossypii
trong 2 ngày. Chủng yếu nhất là L. fusisporum 4078 cũng diệt được 50% hai loại rệp trên trong 4 ngày [143]. Chủng L. lecanii CS-625 trong nghiên cứu của Kim và đồng tác giả (2001) diệt được 50% rệp A. gossypii sau 3 ngày ở 20°C [71].
Trong nghiên cứu của Kim và đồng tác giả (2008), chủng L. attenuatum
CNU-23 với nồng độ bào tử 108/ml diệt được 80% rệp M. persicae trong điều
kiện 25 ± 2°C và độ ẩm 85 ± 5% [68]. Các chủng Lecanicillium trong thí nghiệm của Vu và đồng tác giả (2007) diệt được 72-100% rệp sau 4-8 ngày phun ở 25°C và độ ẩm 75% [143]. Ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm này, các chủng nấm chúng tôi khảo sát có khả năng diệt rệp thấp hơn so với nghiên cứu của Vu và đồng tác giả (2007). Trong một nghiên cứu khác, chủng nấm L. lecanii CS-626 diệt được 98,2% bướm trắng trong nhà kính ở 25 C sau 7 ngày [79], chủng nấm
L. attenuatum CS625 diệt được 100% rệp sau 5 ngày [70].
Như vậy, chủng nấm chúng tôi khảo sát đều có khả năng diệt rệp hại rau cải. Tuy nhiên, so với các chủng nấm đã công bố trên thế giới thì chủng nấm của chúng tôi khảo sát có tỉ lệ rệp chết thấp hơn. Ở Việt Nam, các công bố về sử dụng chế phẩm bào tử nấm để diệt rệp còn rất hạn chế. Hướng nghiên cứu của các nhóm tác giả đã chứng minh tính hiệu quả trong chiến lược sử dụng chế phẩm bào tử nấm để diệt rệp nói riêng và côn trùng nói chung.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Dựa trên cơ chế gây bệnh của nấm trên côn trùng theo con đường chính là bào tử nảy mầm phát triển thành hệ sợi ăn sâu vào khoang bụng, qua đường tiêu hóa, thông qua các khí quản và chúng phủ kín các lỗ khí côn trùng làm chúng chết. Do vậy, hướng nghiên cứu về tốc độ phát triển sợi nấm, tỉ lệ nảy mầm của bào tử và các nghiên cứu về chitinase được tiến hành nghiên cứu góp phần chứng minh cho khả năng diệt rệp của bào tử nấm L. lecanii. Mặt khác, trong
quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được thời gian. Đặc điểm này đã gợi ý chúng tôi tiếp tục nghiên cứu phối trộn enzyme với bào tử nấm L. lecanii có thể được tiến hành trong thời gian tới nhằm nâng cao hơn
hiệu quả diệt rệp của chế phẩm bào tử nấm.
A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
E
Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và biểu đồ
thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H
A và B: Mẫu rệp trước khi phun; C: Mẫu nấm mọc trên rệp sau phun; D: hình ảnh nấm mọc trên quan sát trên kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần; E: Biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Chủng nấm L. lecanii
8 chủng nấm L. lecanii
ng định chủng này là L. lecanii và được đăng kí trong GenBank với mã số JX665044.
1.2. Exochitinase từ L. lecanii 43H tinh sạch được có khối lượng phân tử khoảng 33 kDa; hoạt tính riêng đạt 167,5 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 1,9%; độ sạch 2,5 lần. Enzyme này
kim loại, dung và chất tẩy rửa khảo sát có ảnh hưởng tới hoạt tính của exochitinase.
1.3. Gen Chit phân lập từ L. lecanii , xác định trình tự nucleotide và đăng kí trong GenBank với mã số JX665045.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thuộc họ glycosyl hydrolase 18 đã được biểu hiện thành công trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao.
rChit đã được tinh sạch có khối lượng phân tử ~45 kDa, hoạt tính riêng đạt 11,93 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 10%, độ sạch 1,8 lần. Enzyme này hoạt
động tốt dưới 35°C và pH 6,0. kim loại,
dung và chất tẩy rửa khảo sát có ảnh hưởng tới hoạt tính của rChit. 1.5. Exochitinase có khả năng ức chế sự phát triển của nấm F. oxysporum và R. solani; rChit làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp và bào tử nấm L. lecanii 43H
có khả năng diệt được rệp.
2. KIẾN NGHỊ
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính của phức hợp chitinase (exochitinase và endochitinase) và bào tử chủng nấm L. lecanii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1. Huu Quan Nguyen, Dinh Thi Quyen, Sy Le Thanh Nguyen, Van Hanh Vu (2015), “An extracellular antifungal chitinase from Lecanicillium lecanii:
purification, properties and application in biocontrol against plant pathogenic fungi”, Turkish Journal of Biology, 39, tr. 6-14.
2. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2014), “Cloning and expression of a gene encoding chitinase from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, In: the 3rd Academic conference on natural science for master and PhD students from Asean countries, tr. 438-445.
3. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi, Phạm Thị Huyền (2013), “Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ nấm Lecanicillium lecanii 43H”, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ,1, tr. 426-430.
4. Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Hữu Quân, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu độc tính của nấm kí sinh côn trùng trên rệp hại ngô Aphids maydis để sản xuất
thuốc trừ sâu sinh học”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, 50(3D), tr. 1009-1015.
5. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu độc tính và đặc tính sinh học của chủng nấm Lecanicillium đối với rệp đào”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 50(3D),
tr. 862-868.
6. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2012), « Biological characteristics and virulence of Lecanicillium lecanii strains against Chinese
cabbage aphids”, In: The 2nd Academic conference on Natural Science for Master and PhD Students from Cambodia-Laos-Malaysia, tr. 423-427.
1. Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain 43H
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2. Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain 43H chitinase gene, partial cds. GenBank: JX665045.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bùi Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Trường, Vũ Duy Thanh, Nguyễn Thị Kim Lý, Nguyễn Đức Doanh, Phan Tố Phượng, Nguyễn Hồng Minh, Lê Thị Ánh Hồng (2009), "Nghiên cứu chuyển gen Chitinase - Glucanase kháng nấm vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens", Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 1, tr. 2-7.
2. Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng (2003), "Khảo sát quá trình cảm ứng enzym chitinaza và celluloza của Trichoderma harzianum - Ảnh hưởng của hai enzym này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii", Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 321-324.
3. Đặng Trọng Lương, Kiều Thị Dung, Nguyễn Thúy Điệp, Phí Công Nguyên, Đặng Thị Minh Trang, Nguyễn Trường Khoa (2005), "Nghiên cứu chuyển gen chitinase kháng nấm vào cây lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaceins", Báo cáo khoa học, hội nghị toàn quốc, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 1295-1297.
4. Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Chikafusa Fukazawa (1999), "Tinh chế và xác định tính chất của chitinase từ đậu tương", Kỷ yếu
Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Tự nhiên Hà Nội,
tr. 585-591.
5. Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương