4. Những đóng góp mới của luận án
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy
Hoạt hóa chủng nấm: Các chủng L. lecanii từ các ống giống được nuôi cấy trên môi trường Czapek lỏng ở 30°C; pH 6,5; lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ.
Nuôi nấm thu sinh khối: Nấm L. lecanii sau khi hoạt hóa được nuôi trong
môi trường MT với cơ chất chitin huyền phù 0,5%, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau 96 giờ nuôi, dịch nổi được ly tâm loại sinh khối tế bào và thu enzym thô.
Nuôi cấy nấm F. oxysporum và R. solani: 2 chủng nấm này được nuôi cấy trên môi trường PDA, ở 30°C trong 120 giờ.
Nuôi cấy E. coli: Tế bào E. coli ở -84 C được hoạt hóa trên đĩa thạch, ủ ở
37°C qua đêm. Một khuẩn lạc trên đĩa thạch được nuôi vào 2 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Các chủng tái tổ hợp được nuôi trong các môi trường tương ứng bổ sung ampicillin (nồng độ cuối cùng 100 µg/ml).
Nuôi biểu hiện: Nấm men P. pastoris X33 được nuôi trong môi trường YP bổ sung glycerol 1,0%, lắc 200 vòng/phút ở 28°C qua đêm, sau đó chuyển sang môi trường YP và tiếp methanol 1,0% hàng ngày để cảm ứng biểu hiện rChit.
Nuôi cấy nấm thu bào tử: Các chủng nấm L. lecanii sau khi hoạt hóa được
nuôi cấy trên môi trường PDA ở 30°C, sau 7 ngày nuôi bào tử được thu hoạch từ bề mặt của đĩa nấm bằng 12 ml dung dịch Tween 80 0,02% và lọc qua 3 lớp vải màn để bào tử tách ra khỏi sợi nấm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nuôi rệp để thử nghiệm: Các cá thể rệp cải được nuôi trên lá cải thảo trong hộp nhựa (4 x 5 x 6 cm3) để ở nhiệt độ khoảng 25-30°C, độ ẩm 80-85%, thời gian chiếu 16 sáng / 8 tối, đảm bảo rệp luôn khỏe mạnh, ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase
Các điều kiện nuôi cấy nấm L. lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase được
khảo sát lần lượt trong 6 thí nghiệm. Yếu tố khảo sát ở thí nghiệm trước được sử dụng ngay cho thí nghiệm tiếp theo (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Các điều kiện nuôi cấy nấm L. lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase
TN Các yếu tố Mức thay đổi
1 Thời gian nuôi cấy
Môi trường MT; pH 5,0 ở 30°C, bổ sung chitin huyền phù 0,5% làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-240 giờ (cách nhau 24 giờ) để xác định hoạt tính chitinase.
2 Nhiệt độ nuôi cấy
Môi trường MT, pH 5,0 bổ sung chitin huyền phù ở nồng độ 0,5%, nuôi lắc 200 vòng/phút ở các nhiệt độ khác nhau 28, 30 và 37°C. Sau 144 giờ nuôi, thu dịch để xác định hoạt tính enzyme.
3 Nồng độ cơ chất cảm ứng
Môi trường MT; pH 5,0 ở 28°C và bổ sung cơ chất chitin huyền phù ở các nồng độ khác nhau 0,1; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0%. Sau 144 giờ nuôi, thu dịch để xác định hoạt tính enzyme.
4 Nguồn nitơ
Môi trường MT; pH 5,0 ở 28°C và bổ sung chitin huyền phù 0,75% làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó, nguồn pepton được thay bằng các nguồn nitơ khác là cao thịt, bột đậu tương, casein, urê, NaNO3, KNO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4NO3 ở nồng độ 0,5%. Sau 144 giờ nuôi, thu dịch để xác định hoạt tính enzyme.
5 Nguồn cabon Môi trường MT; pH 5,0 ở 28°C và bổ sung chitin huyền phù 0,75% làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó, nguồn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cao nấm men được thay bằng các nguồn cacbon khác là glucose, bột ngô, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt, tinh bột, bã sắn ở nồng độ 0,5%. Sau 144 giờ nuôi, thu dịch để xác định hoạt tính enzyme.
8 pH môi trường
Môi trường MT, có pH thay đổi từ 4,0-9,0 (cách nhau 0,5) ở 30°C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trường tối ưu. Sau 144 giờ nuôi, thu dịch để xác định hoạt tính enzyme.
2.2.1.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy cho biểu hiện chitinase tái tổ hợp
Các điều kiện nuôi cấy nấm men P. pastoris X33 sinh tổng hợp chitinase tái tổ hợp được khảo sát lần lượt trong 3 thí nghiệm. Yếu tố khảo sát ở thí nghiệm trước được sử dụng ngay cho thí nghiệm tiếp theo.
Môi trường biểu hiện: Để lựa chọn môi trường thích hợp cho biểu hiện rChit, chủng nấm men tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong 5 môi trường khác nhau (BMM, BMMY, YP, MM, MMY, YP+YNB); pH 7,0 nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28°C. Mẫu nuôi biểu hiện được thu để xác định mật độ tế bào và hoạt tính rChit.
Thời gian thu mẫu: Để xác định thời gian thu mẫu tối ưu cho biểu hiện rChit, chủng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp được nuôi trong môi trường
YP lỏng; pH 7,0 nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28°C, thu mẫu và tiếp cảm ứng bằng methanol 1,0% sau mỗi 24 giờ. Mật độ tế bào và hoạt tính enzyme tại các thời điểm khảo sát được xác định.
Nồng độ chất cảm ứng: Để xác định nồng độ methanol đến quá trình cảm ứng biểu hiện rChit, chủng nấm men tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường YP lỏng, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tối ưu, bổ sung methanol với các nồng độ 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5%. Dịch nuôi biểu hiện được thu để xác định mật độ tế bào và hoạt tính chitinase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu trên enzyme/protein
2.2.2.1. Định tính chitinase
Hoạt tính chitinase được định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa cơ chất chitin huyền phù 0,5% trong nước cất dày khoảng 0,5 cm, được đục lỗ đường kính 0,5 cm. 50 μl dịch enzyme được cho vào mỗi giếng rồi ủ 12 giờ trong 4 C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch được ủ 4-6 giờ ở 37 C lấy ra và nhuộm bằng 1,0% lugol. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R - r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tương đối của enzyme.
2.2.2.2. Xác định hoạt tính chitinase
Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân chitin huyền phù bằng chitinase sau đó bất hoạt enzym và tạo phản ứng màu bằng DNS. Lượng đường N-acetyl glucosamine tạo ra được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm dựa vào cường độ màu tạo ra bởi phức với thuốc thử. Tính lượng sản phẩm tương ứng do enzym xúc tác tạo nên dựa trên đồ thị đường chuẩn [92].
Tiến hành đo:
Ống thí nghiệm: 1,2 ml dung dịch chitin huyền phù 0,5% trong đệm natri photphat pH 7,0 được cho vào ống nghiệm, thêm 0,3 ml dịch enzyme. Hỗn hợp được lắc đều và ủ 30 phút ở 37 C sau đó bổ sung 2ml DNS và đun sôi trong 10 phút. Để lạnh, sau đó hỗn hợp được li tâm 8000 vòng trong 5 phút loại bỏ chitin không tan và so màu ở bước sóng 540 nm.
Ống kiểm tra: Hút 1,2 ml cơ chất chitin huyền phù, thêm các hóa chất định lượng đường khử, sau đó bổ sung 0,3 ml dịch enzyme và tiến hành tương tự như ống thí nghiệm.
Dựng đường chuẩn: N-acetyl glucosamine được pha trong đệm natri acetate 100mM; pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-100 µg/ml. Một ml dung dịch chuẩn được đo ở bước sóng 540 nm. Độ hấp phụ và nồng độ N-acetyl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
glucosamine được vẽ theo chương trình Excel. Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10-100 µg/ml. Đường chuẩn có phương trình y = 0,0064x - 0,0024 (Hình 2.1). Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ N-acetyl glucosamine (µg/ml).
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller
Đơn vị hoạt tính (U) là lượng enzyme phân giải cơ chất chitin thành đường khử tương đương 1 g N-acetyl glucosamine trong 1 giờ ở 40 C.
2.2.2.3. Tinh sạch chitinase tự nhiên
100 ml dịch enzyme sau khi ly tâm ở 12500 vòng/phút trong 10 phút được tủa với muối ammonium sulfate bão hòa ở nồng độ 65% và để ở 4 C qua đêm [31]. Sau khi ly tâm 12500 vòng/phút, ở 4 C, tủa được hòa với 10 ml đệm natri photphat 50 mM pH 7,0 và thẩm tích loại muối. Dịch tủa sau khi loại muối (9 ml) được đưa qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex A-50 (2,6 x 60 cm) đã được cân bằng với 150 ml đệm Tris-HCl 50 mM; pH 7,0; tốc độ chảy là 30 ml/giờ. Protein được thu lại với đệm Tris-HCl 50 mM pH 7,0 có chứa NaCl ở nồng độ từ 0-1,0 M, tốc độ chảy là 24 ml/h cho đến khi OD<0,01. Thể tích mỗi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phân đoạn là 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn, sau đó điện di trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra độ tinh sạch (Hình 2.2).
2.2.2.4. Tinh sạch chitinase tái tổ hợp
Dịch nuôi cấy được ly tâm 12500 vòng/phút trong 10 phút. 50 ml dịch ngoại bào được cô lại bằng cột Millipore 10 kDa. Dịch cô mẫu (9 ml) được cho qua cột sắc khi trao đổi ion DEAE-Sephadex A-50 (2,6 × 6 cm) đã được rửa và cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl pH 7,0. Protein được thôi ra với đệm 50 mM Tris-HCl pH 7,0 chứa 0-1,0 M NaCl, tốc độ chảy 24 ml/h cho đến khi OD280 < 0,01. Mỗi phân đoạn được thu lại với thể tích 1,5 ml. Các phân đoạn có hoạt tính enzyme cao được tập hợp lại và sử dụng để đánh giá tính chất chitinase. Tất cả các bước tinh sạch được thực hiện ở 4°C.
Hình 2.2. Các bước tinh sạch chitinase
2.2.2.5. Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
Nguyên tắc: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein polyacrylamide với nồng độ 12,5% theo phương pháp điện di biến tính [78].
Dịch nuôi cấy
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút
Dịch trong
Thẩm tích loại muối
Qua cột DEAE-Sephadex A-50
Enzyme tinh sạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thành phần gel như bảng 2.3. Bản điện di được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ dòng điện 20 mA cho lớp gel cô và 30 mA cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng AgNO3 0,1% (w/v). Các protein dưới dạng monomer tinh sạch xuất hiện một băng duy nhất.
Bảng 2.3. Thành phần gel cô và gel tách
Thành phần Gel tách (µl) Gel cô (µl)
H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015 2.2.2.6. Xác định hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue G-250 sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.3).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ y = 0.0015x - 0.0717 R2 = 0.9947 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ BSA (µg/ml) O D ( 59 5n m)
Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford
2.2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp
Động học của phản ứng enzyme
Động học của phản ứng enzyme được xác định qua hằng số Michaelis- Menten, Km và vận tốc phản ứng tối đa.
Nguyên tắc: Để xác định hằng số Km dựa vào phương trình Lineweaver Burk:
max max 0 1 1 1 V S V K v m Trong đó:
Đường biểu diễn cắt trục tung ở điểm 1/Vmax và cắt trục hoành ở điểm -1/Km. Từ đó có thể tính được các giá trị Vmax, Km.
Cách tính: Xác định vận tốc phản ứng tại các nồng độ cơ chất khác nhau (Bảng 2.4 và Hình 2.4).
Vo là vận tốc ban đầu Vmax là vận tốc cực đại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 2.4. Quan hệ giữa 1/[S] và 1/V [S] 1/[S] V 1/V [S1] 1/[S1] V1 1/V1 [S2] 1/[S2] V2 1/V2 [S3] 1/[S3] V3 1/V3 [S4] 1/[S4] V4 1/V4 Hình 2.4. Đồ thị Lineawever-Burk Nhiệt độ và pH tối ƣu
Nhiệt độ và pH tối ưu của chitinase tự nhiên và rChit được xác định bằng cách đo hoạt tính enzyme theo phương pháp đã mô tả ở trên sử dụng đệm natri acetate 20 mM (pH 3,5-6,0) và đệm natri phosphate 20 mM (pH 6,0-8,0) ở 40 C; và trong dải nhiệt độ thay đổi từ 20-70 C tại pH 7,0.
Độ bền nhiệt và độ bền pH
Đánh giá độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase tự nhiên, dịch enzyme đã tinh sạch (6 g cho mỗi phản ứng) được ủ với các nhiệt độ khác nhau 30, 37 và 40 C ở pH 6,5 trong khoảng thời gian từ 0-84 giờ và dải pH khác nhau từ 4,0-8,0 (pH 4,0-6,0 với đệm natri acetate; pH 7,0-8,0 với đệm natri phosphate) ở 40 C trong các khoảng thời gian từ 0-48 giờ. Hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.
Đối với rChit, dịch enzyme đã tinh sạch (4,5 g cho mỗi phản ứng) được ủ ở các nhiệt độ khác nhau 30, 37 và 40 C ở pH 6,0 và ở dải pH khác nhau từ 5,0-8,0 (pH 5,0-6,0 đệm natri acetate; pH 7,0-8,0 với đệm natri phosphate) ở 40 C, sau các khoảng thời gian từ 0-24 giờ. Hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Ảnh hƣởng của ion kim loại, chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ
Dịch chitinase tự nhiên tinh sạch (6 g cho mỗi phản ứng) được ủ với các ion kim loại (Ag+
, Al3+, Ba2+, Ca2+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, K+, Mg2+, Mn2+, Ni2+ và Zn2+) và EDTA nồng độ 5-15 mM, với các dung môi hữu cơ (acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol) nồng độ 10-30% và với các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, SDS, Triton X-114 và Triton X-100) nồng độ 0,5-2% ở 40 C. Sau 2 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.
Dịch rChit tinh sạch (4,5 g cho mỗi phản ứng) được ủ với các thành phần như trên ở 37 C. Sau 2 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.
Xác định sản phẩm của sự thủy phân enzyme với cơ chất
Để xác định sản phẩm thủy phân chitin huyền phù, 600 µl của chitin huyền phù 0,5% pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 6,0 được ủ với 100 µl của 6 µg chitinase tinh sạch ở 40°C trong 96 giờ. Sản phẩm tạo ra được xác định trên bản TLC (là một lớp silica gel 60 có kích thước 20×20 cm, Merck, Darmstadt, Germany) thực hiện với một pha động của hệ dung môi n-butanol/acetic acid/nước (2:1:1, v/v/v). Sau đó, bản TLC được phun với acid sulfuric 10% pha trong ethanol và ủ ở 120°C trong 15 phút. Đường N-acetyl glucosamine được sử dụng làm chất chuẩn.
2.2.3. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.3.1. Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc
Tế bào nấm được nuôi cấy trong 100 ml môi trường Czapek ở 30 C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ dịch canh trường được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa tế bào (2g) được nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ, sau đó được bổ sung 600 l đệm lysis và lắc nhẹ. Sau khi bổ sung 65 l lysozyme, hỗn hợp được ủ ở 37 C trong 45 phút, cho 25 l protease K ủ ở 56 C trong 2-3 giờ. Bổ sung tiếp hỗn hợp chloroform:isoamyl alcohol (24:1) với thể tích tương đương, trộn đều trong 5 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phút. Hút 500 l dịch nổi chứa DNA sang ống eppendorf mới và bổ sung 500 l isopropanol. Hỗn hợp được đảo nhẹ và tủa DNA ở -20 C trong 30 phút. Tủa sau khi ly tâm được rửa bằng 500 l ethanol 70% để loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khô, hòa trong 40 l