4. Những đóng góp mới của luận án
3.2.1. Tinh sạch chitinase
Chitinase được sinh ra từ nấm L. lecanii thường có độ tinh khiết không cao do lẫn nhiều protein khác. Vì vậy, quá trình tinh sạch để thu được chitinase tinh khiết phục vụ cho quá trình đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme và sử dụng chúng cho những ứng dụng trong thực tiễn là rất cần thiết.
Sau khi khảo sát quá trình tủa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H với
muối ammonium sulphate ở các nồng độ từ 45-95% (cách nhau 5%), chúng tôi đã lựa chọn được nồng độ muối ammonium sulphate thích hợp cho quá trình tủa chitinase để tinh sạch là 65%. Ở nồng độ muối ammonium sulphate 65%, hoạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tính chitinase thu được đạt 92,11 U/mg protein, độ sạch 1,4 lần và hiệu suất thu hồi đạt 15,7%. Chitinase sau khi tủa muối ammonium sulphate và thẩm tích loại muối được đưa qua cột DEAE-Sephadex A-50. Chitinase đã được tinh sạch với độ sạch 2,5 lần và hiệu suất thu hồi đạt 1,9%. Enzyme tinh sạch này có hoạt tính riêng đạt 167,5 U/mg (Bảng 3.1) và chỉ ra một băng protein duy nhất trên bản gel khi nhuộm bằng AgNO3 0,1%, khối lượng phân tử của protein này khoảng 33 kDa (Hình 3.7A). Dịch chitinase trước tinh sạch và các phân đoạn qua cột có hoạt tính được định tính trên đĩa thạch có chứa chitin huyền phù 0,5%, các giếng đều xuất hiện vòng phân giải chitin màu trắng sau khi nhuộm bằng lugol 1,0% (Hình 3.7B). Như vậy, chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H đã được tinh sạch.
Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L .lecanii 43H
Bước tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt tính tổng số (U) Hoạt tính riêng (U/mg) Độ sạch (lần) Hiệu suất (%) Enzyme thô 0,800 52,800 66,00 1,0 100,0 Tủa muối (NH4)2SO4 0,090 8,290 92,11 1,4 15,7 DEAE-Sephadex A-50 0,006 1,005 167,50 2,5 1,9 A B kDa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7. Điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch (A) và hoạt tính chitinase
của các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù 0,5% (B)
Giếng 1: enzyme thô, giếng 2: enzyme tủa muối (NH4)2SO4 65%, giếng 3-8 ứng với các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A-50, M: thang chuẩn.
Độ sạch của chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H chúng tôi nghiên cứu
đạt 2,5 lần; kết quả nghiên cứu này thấp hơn so với chitinase từ nấm
M. anisopliae (4,98 lần) và G. virens (105 lần). Tuy nhiên, độ sạch của chitinase
từ chủng nấm L. lecanii 43H lại cao hơn so với chitinase từ nấm T. hariuzaum (1,3 lần). Hiệu suất tinh sạch chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H đạt 1,9%. So với một số nghiên cứu đã báo cáo của St. Leger và đồng tác giả (1991) [128], di Pietro và đồng tác giả (1993) [33], Harma và đồng tác giả (1993) [51], hiệu suất tinh sạch chitinase chúng tôi nghiên cứu là thấp hơn. Hoạt tính riêng của chitinase trong nghiên cứu của chúng tôi đạt 167,5 U/mg cao hơn so với chitinase từ nấm T. harizum (hoạt tính đạt từ 1,1-2,3 U/mg) và thấp hơn so với chitinase từ nấm G. virens (hoạt tính là 10118,5 U/mg).
Chitinase có bản chất là protein. Dựa vào khối lượng phân tử (MW), chitinase từ nấm Lecanicillium được chia ra làm 4 nhóm: Nhóm I có MW ≤ 26
kDa từ chủng nấm L. lecanii [91], [118]; L. fungicola [111], [112]; L. muscarium [23]; nhóm II có MW từ 32-33 kDa của chủng nấm L. lecanii [83], [118]; L. fungicola [111]; nhóm III có MW từ 40-50 kDa từ L. lecanii [40], [83], [84],
[118]; L. chlamydosporium và L. suchlasporium [136], L. fungicola [111], L. psalliotae [42] và nhóm IV có MW ≥ 55 kDa từ chủng nấm L. muscarium
[23], L. fungicola [111], [112]. Như vậy, chitinase chúng tôi nghiên cứu có khối lượng khoảng 33 kDa được xếp vào nhóm II.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/