C. dài P.ứng dài P.ứng dài P.ứng
3.3.1đánh giá các dòng ựơn bội kép thu ựược từ nuôi cấy bao phấn các cá thể lai mang gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5, Xa7 (Sơ ựồ lai 1)
mang gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5, Xa7 (Sơ ựồ lai 1)
3.3.1.1 Xác ựịnh dòng ựơn bội kép (ký hiệu MT5) mang gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5 (Tổ hợp lai MT508-1/IRBB5)
Các dòng bố, mẹ và 9 dòng ựơn bội kép ựược thu mẫu lá ở giai ựoạn muộn (khi cây ựã ựẻ nhánh và có nhiều lá) ựảm bảo cho cây khoẻ mạnh ựể thu hạt.
Các ADN thu ựược phải có ựộ tinh sạch cao và không bị gẫy
Hình 3.16: Xác ựịnh dòng ựơn bội kép mang gen kháng xa5 bằng chỉ thị phân tử
Trình tự các mẫu (từ trái qua phải):100bp DNA lađer, MT508-1, IRBB5, MT5.1(1), MT5.2(2), MT5.4(3), MT5.7(4), MT5.3(5), MT5.5(6), MT5.6(7), MT5.8(8), MT5.9(9) - vụ xuân muộn 2007
Hình 3.16 là hình ảnh phân tắch kết quả PCR của các dòng ựơn bội kép với chỉ thị RM 6320 ựể xác ựịnh dòng ựơn bội kép mang gen kháng xa5.
Hình 3.16 cho thấy sản phẩm ADN khuyếch ựại ựạt 100%, có sự ựa hình với các alen kắch thước phân tử từ 175 ựến 200 bp. Trong ựó giống MT508-1 có kắch thước phân tử khoảng 175 bp (không mang gen kháng xa5) và dòng IRBB5 có kắch thước phân tử khoảng 200 bp (có mang gen kháng xa5). Thông qua kết quả ựiện di trên gel, thấy 3 dòng MT5.2, MT5.4, MT5.7 thể hiện vạch băng có kắch thước khoảng 200 bp (có mang gen kháng xa5) giống vạch băng của dòng IRBB5 và 6 dòng còn lại: MT5.1, MT5.5, MT5.6, MT5.3, MT5.8, MT5.9 có vạch băng với kắch thước phân tử khoảng 175 bp (không mang gen kháng xa5) giống như giống MT508 (Bảng 5- phụ lục 2)
3.3.1.2 Xác ựịnh dòng ựơn bội kép (ký hiệu MT7) mang gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa7 (Tổ hợp lai MT508-1/IRBB7)
Thông qua kết quả ựiện di trên gen của 13 dòng DH (ký hiệu MT7) thu ựược từ nuôi cấy bao phấn tổ hợp lai MT508-1/IRBB7 (F1.7) ở hình 3.17 thấy có 6 dòng:
MT7.1, MT7.3, MT7.4, MT7.6, MT7.10, MT7.7 thể hiện vạch băng có kắch thước khoảng 300 bp (có mang gen kháng Xa7) giống vạch băng của dòng IRBB7 và 7 dòng còn lại có vạch băng với kắch thước phân tử khoảng khoảng 275 bp (không mang gen kháng Xa7) giống vạch băng của dòng MT508 (Bảng 6 - phụ lục 2)
Hình 3.17: Xác ựịnh dòng ựơn bội kép mang gen kháng Xa7 bằng chỉ thị phân tử
Trình tự các mẫu (từ trái qua phải):50bp DNA lađer, IRBB7, MT508-1, MT7.2(1), MT7.1(2), MT7.3(3), MT7.12(4), MT7.5(5), MT7.9(6), MT7.4(7), MT7.8(8), MT7.6(9), MT7.10(10), MT7.11(11),
* đánh giá tắnh kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa ựơn bội kép mang gen kháng xa5, Xa7 bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo
Các dòng ựơn bội kép mang gen kháng xa5 và Xa7 ựược lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn bạc lá ựể xác ựịnh kiểu hình kháng bệnh trên ựồng ruộng. Thắ nghiệm lây nhiễm ựược lặp lại ắt nhất 2 lần ở 2 ựịa ựiểm khác nhaụ Giống ựối chứng kháng là IRBB5, IRBB7 và giống ựối chứng nhiễm là IR24 và MT508-1
Bảng 3.14: Phản ứng của các dòng ựơn bội kép (MT5 và MT7) mang gen kháng bệnh với các chủng bạc lá - vụ mùa 2007
Phản ứng của các dòng DH với các chủng bạc lá khác nhau
Chủng 3 Chủng 9 Chủng 19 TT Tên dòng Gen kháng C. dài vết bệnh (cm) P.ứng C. dài vết bệnh (cm) P.ứng C. dài vết bệnh (cm) P.ứng 1 MT508-1 19,5ổ2,1 HS 19,8ổ1,8 HS 13,7ổ1,5 S 2 IRBB5 xa5 8,5ổ1,8 M 5,7ổ1,6 R 7,7ổ2,3 R 3 MT5.2 xa5 6,2ổ0,8 R 7,9ổ 0,6 R 7,8ổ0,4 R 4 MT5.4 xa5 7,8ổ3,0 R 6,1ổ0,8 R 8,5ổ0,5 M 5 MT5.7 xa5 8,1ổ1,1 M 4,2ổ0,5 R 5,7ổ0,1 R 6 IRBB7 Xa7 5,6ổ2,5 R 4,3ổ2,7 R 8,7ổ2,1 M 7 MT7.1 Xa7 8,4ổ1,0 M 6,5ổ0,7 R 7,6ổ1,3 R 8 MT7.3 Xa7 4,8ổ1,8 R 5,1ổ1,1 R 8,1ổ0,9 M 9 MT7.4 Xa7 8,7ổ0,6 M 6,3ổ1,7 R 7,5ổ1,1 R 10 MT7.6 Xa7 7,9ổ0,4 R 4,9ổ0,7 R 9,0ổ0,5 M 11 MT7.7 Xa7 5,5ổ0,6 R 4,8ổ0,9 R 4,4ổ0,2 R 12 MT7.10 Xa7 6,0ổ1,1 R 5,6ổ0,7 R 9,3ổ0,7 M 13 IR24 (ự/c nhiễm) 18,0ổ1,3 HS 18,5ổ1,8 HS 13,8ổ1,2 S
Ghi chú: đánh giá theo thang ựiểm 5 cấp (Jica, 2003)
Bảng 3.14 là kết quả ựánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo các dòng ựơn bội kép MT5 và MT7 với các chủng bạc lá trên ựồng ruộng.
Các dòng DH ựều thể hiện kiểu hình kháng và kháng trung bình (R và M) với các chủng bạc lá sử dụng trong thắ nghiệm, tương tự 2 dòng mang gen kháng IRBB5, IRBB7 (hình minh hoạ 3.18).
Hình 3.18: Phản ứng của dòng ựơn bội kép MT5.4 với chủng bạc lá HAU02040 - trường đH Nông nghiệp Hà Nội
Qua xác ựịnh kiểu gen và kiểu hình kháng bệnh trên ựồng ruộng có thể kết luận rằng: có 3/9 dòng DH mang gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5 và 6/13 dòng DH mang gen Xa7. Tất cả các dòng DH ựều mang gen kháng ở trạng thái ựồng hợp tử.
3.3.1.3 Xác ựịnh dòng ựơn bội kép (ký hiệu MT5/7) mang gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5, Xa7 thu ựược từ nuôi cấy bao phấn (Tổ hợp lai MT508-1/IRBB5 x MT508- 1/IRBB7 ký hiệu F5/7)
* Xác ựịnh các dòng DH mang gen kháng xa5 và Xa7 bằng chỉ thị phân tử
Các dòng DH (21 dòng) thu ựược từ nuôi cấy bao phấn tổ hợp lai F5/7 ựược ký hiệu là MT5/7.1, MT5/7.2 Ầ.MT5/7.21. Sau khi ựược lấy lá, tách chiết ADN, kiểm tra ựộ tinh sạch của ADN, các dòng này ựược chạy gen ựể xác ựịnh dòng DH mang gen kháng vi khuẩn bạc lá.
Hình 3.19: Kết quả ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR của các dòng MT5/7
Chỉ thị ựược sử dụng là RM6320 liên kết gen xa5(a) và P3 liên kết gen Xa7(b). Các dòng DH thu ựược từ nuôi cấy bao phấn tổ hợp lai F5/7 theo thứ tự MT5/7.1(1)Ầ.MT5/7.21(21)
ADN tinh sạch của các dòng DH ựược khuyếch ựại bằng PCR với mồi RM6320 và mồi P3 liên kết gần với các gen xa5 và Xa7 (Hình 3.19a và hình 3.19b). Kết quả (bảng 7 - phụ lục 2) cho thấy ở cả 2 chỉ thị ựều cho tỷ lệ phân ly 1:1 với 2 kiểu băng: ựồng hợp tử giống giống kháng - thể cho gen (Kắch thước khoảng 200bp, 300bp) và ựồng hợp tử giống với giống nhiễm - thể nhận gen (kắch thước khoảng 175bp, 275bp). Kết quả ựọc gen ở cả 2 hình a và b cho thấy: có 4/21 dòng DH (MT5/7.6, MT5/7.8, MT5/7.12, MT5/7.17) thể hiện vạch băng có kắch thước tương ựương vạch băng của dòng mang gen kháng IRBB5 (~ 200bp), có 5/21 dòng DH (MT5/7.5, MT5/7.10, MT5/7.11, MT5/7.15, MT5/7.16) thể hiện vạch băng kắch thước khoảng 300bp (có mang gen Xa7) tương ựương vạch băng của dòng mang gen kháng IRBB7 và có 5/21 dòng đBK (MT5/7.1, MT5/7.3, MT5/7.13, MT5/7.20, MT5/7.21) thể hiện cả 2 vạch băng, kắch thước băng tương tự là ~ 200bp, ~ 300bp. Như vậy là ựã có 5 dòng DH mang cả 2 gen kháng xa5 và Xa7. (Xem phần phụ lục)
để chắc chắn các dòng DH có mang gen kháng bệnh bạc lá, công việc ựánh giá kiểu hình kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo với các chủng bạc lá hữu hiệu trên ựồng ruộng ựã ựược tiến hành.
* đánh giá tắnh kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa DH mang gen kháng xa5 và Xa7 bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các dòng lúa ựơn bội kép ựược lây nhiễm bệnh nhân tạo ựể ựánh giá tắnh kháng bệnh của chúng trên ựồng ruộng.
Sau 18-20 ngày lây nhiễm tiến hành ựo chiều dài vết bệnh. đo toàn bộ các lá lây nhiễm, ựo từ ựầu vết cắt xuống phắa dưới ựến hết vết bệnh, tắnh trung bình. Kết quả ựo ựếm ựược xử lý và ựược trình bày ở bảng 3.15.
Kết quả lây nhiễm bệnh cho thấy: 5 dòng DH mang 2 gen kháng phản ứng với các chủng bạc lá tương ựương dòng mang ựa gen kháng IRBB62, thể hiện kiểu hình kháng bệnh tốt nhất (HR - hầu như không xuất hiện vết bệnh), 9 dòng DH mang một gen kháng xa5 hoặc Xa7 thể hiện kiểu hình kháng bệnh tương ựương dòng mang ựơn gen kháng IRBB5, IRBB7, ựược ựánh giá ở thang ựiểm R (vết bệnh từ 3 - 8cm) và thang ựiểm M (vệt bệnh dài từ 8 - 12 cm). Các dòng MT508-1 và dòng nhiễm chuẩn IR24 bị nhiễm cao (S, HS) với các chủng bạc lá sử dụng trong thắ nghiệm (vết bệnh > 12cm).
Bảng 3.15: Phản ứng của các dòng ựơn bội kép (MT5/7) mang gen kháng với các chủng bạc lá khác nhau - Vụ mùa 2008
Phản ứng của các dòng DH với các chủng bạc lá khác nhau
Chủng 3 Chủng 9 Chủng 19 TT Tên dòng Gen kháng C. dài vết bệnh (cm) Phản ứng C. dài vết bệnh (cm) Phản ứng C. dài vết bệnh (cm) Phản ứng 1 MT508-1 19,5ổ2,1 HS 19,8ổ1,8 HS 13,7ổ1,5 S 2 IRBB5 xa5 6,5ổ1,8 R 9,7ổ1,6 M 7,7ổ2,3 R 3 MT5/7.6 xa5 6,7ổ1,8 R 5,8ổ1,8 R 8,2ổ0,8 M 4 MT5/7.8 xa5 5,2ổ0,8 R 7,7ổ0,6 R 4,8ổ1,2 R 5 MT5/7.12 xa5 7,1ổ1,1 R 8,9ổ0,4 M 5,2ổ1,8 R 6 MT5/7.17 xa5 6,8ổ3,0 R 6,5ổ0,8 R 8,9ổ1,5 M 7 IRBB7 Xa7 5,6ổ2,5 R 7,3ổ2,7 R 8,1ổ2,1 M 8 MT5/7.5 Xa7 6,2ổ1,2 R 8,7ổ1,8 M 4,9ổ 0,6 R 9 MT5/7.10 Xa7 7,1ổ1,1 R 5,2ổ0,8 R 7,2ổ0,5 R 10 MT5/7.11 Xa7 6,8ổ3,0 R 4,7ổ1,8 R 8,7ổ1,6 M 11 MT5/7.15 Xa7 5,9ổ1,1 R 8,7ổ1,6 M 4,3ổ1,1 R 12 MT5/7.16 Xa7 6,8ổ3,0 R 7,8ổ0,4 R 7,9ổ0,7 R 13 MT5/7.1 xa5, Xa7 0,4ổ0,2 HR 0,7ổ0,2 HR 0,6ổ0,5 HR 14 MT5/7.3 xa5, Xa7 0,7ổ0,4 HR 1,2ổ0,8 HR 1,6ổ0,3 HR 15 MT5/7.13 xa5, Xa7 1,4ổ0,5 HR 0,8ổ0,5 HR 0,9ổ0,5 HR 16 MT5/7.20 xa5, Xa7 0,7ổ0,3 HR 0,5ổ0,7 HR 1,7ổ0,7 HR 17 MT5/7.21 xa5, Xa7 0,6ổ0,2 HR 0,6ổ0,3 HR 1,0ổ0,6 HR
18 IRBB62 xa5, Xa7 0,5ổ0,3 HR 0,2ổ0,1 HR 0,7ổ0,4 HR
19 lR24 (ự/c
nhiễm) 18,0ổ1,3 HS 18,5ổ1,8 HS 13,8ổ1,2 S
Ghi chú: đánh giá theo thang ựiểm 5 cấp (Jica, 2003)
Kết quả kiểm tra kiểu gen bằng cặp mồi RM6320 cho gen xa5, P3 cho gen
Xa7 ựã trùng với kết quả kiểm tra kiểu hình kháng bệnh trên ựồng ruộng. Như vậy, sử dụng MAS ựể chọn lọc kiểu gen kháng có ựộ chắnh xác rất cao và rất hiệu quả.
3.3.1.4 đánh giá ựặc ựiểm nông - sinh học chắnh của các dòng ựơn bội kép mang gen kháng xa5, Xa7
Các dòng DH mang gen kháng thu ựược theo sơ ựồ chọn tạo 1 ựược ựánh giá về một số ựặc ựiểm nông - sinh học chắnh ựể xác ựịnh dòng triển vọng. Số liệu theo dõi, ựánh giá các dòng ựơn bội kép ở vụ Mùa, sau khi xử lý, ựược trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16: Một số ựặc ựiểm nông - sinh học chắnh của các dòng ựơn bội kép mang gen kháng Ờ Sơ ựồ lai 1 (vụ mùa 2008)