1.3.1.1 Khái niệm về chỉ thị di truyền và chỉ thị phân tử
Chỉ thị di truyền là bất kỳ một ựặc tắnh nào có thể ựo ựếm ựược về mặt hình thái, sinh hóa hoặc phân tử, có thể di truyền ựược. Một tắnh trạng ựược coi là chỉ thị di truyền cần phải có hai yêu cầu cơ bản:
a/ Có sự khác biệt giữa bố và mẹ;
b/ Phải ựược truyền lại chắnh xác cho hậu thế.
Trên cơ sở ựó người ta chia chỉ thị di truyền ra làm 3 loại: Chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tử ADN.
Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là ựa hình ADN. Nó có thể là những dòng phân tử ADN ựược lưu trữ (ựoạn ADN ựứng riêng hoặc nằm trong plasmid, thư viện λ, BAC, YAC...) hay dưới dạng thông tin về trình tự ựược lưu giữ trong máy tắnh hay trên mạng internet (vắ dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP...).
đặc ựiểm của chỉ thị phân tử ADN: - rất nhiều ựa hình
- là ựồng trội hoặc trội
- nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại Ộựơn locus - nhiều alenỢ - không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường
Chỉ thị phân tử (CTPT) ADN có nhiều loại, ựa dạng và ổn ựịnh trong mọi giai ựoạn của sinh vật. Cây trồng có khoảng 108 Ờ 1010 nucleotit trong ADN tổng số. Thậm chắ, nếu chỉ tắnh một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể ựã dẫn ựến một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể ựó. Chỉ thị phân tử ADN có ưu ựiểm hơn
nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá sinh. CTPT ADN rất phong phú do sự ựa dạng của ADN, chúng có tắnh ổn ựịnh và không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường cũng như giai ựoạn phát triển của sinh vật. Một chỉ thị ADN lý tưởng phải ựạt các yêu cầu sau: Bản chất cho ựa hình cao, di truyền ựồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, tập tắnh chọn lọc trung tắnh (trình tự ADN của cơ thể nào cũng là trung tắnh với các ựiều kiện môi trường), dễ tiếp cận, phân tắch nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn tất cả những ựiều kiện trên. Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn ựược một số ựiều kiện.
Chỉ thị phân tử ựược chia làm 4 loại chắnh: - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
- Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR
- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lạị Nhóm chỉ thị này thực ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp vào một nhóm riêng.
- Các chỉ thị phân tử khác
1.3.1.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)
đặc ựiểm của chỉ thị RFLP:
- Là chỉ thị ựồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một lôcut gen. Do vậy có thể phân biệt ựược các thể ựồng hợp tử (AA hoặc BB) và các cá thể dị hợp tử AB.
- Chỉ thị RFLP rất ựáng tin cậy, dùng ựể kiểm tra các chỉ thị phân tử khác. - Hạn chế của chỉ thị RFLP: phương pháp phát hiện RFLP tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh.
1.3.1.3 Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR
- Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs Ờ đa hình các ựoạn ADN khuếch ựại ngẫu nhiên)
Loại chỉ thị này ựược sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những ựoạn ADN hệ gen, sử dụng những ựoạn mồi ựơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 10 nucleotit dưới nhiệt ựộ kết cặp thấp (khoảng 370C). Sản phẩm của phản ứng ựược phân tách bằng ựiện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới ựèn tắm. RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những băng ADN ựặc trưng. Vì vậy không phân biệt ựược thể dị hợp tử. đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị ựồng trội RFLP. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là công cụ hữu hiệu trong việc lập bản ựồ những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lạị
- Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism Ờ đa hình chiều dài các ựoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Loại chỉ thị này ựược sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản ựồ gen và xác ựịnh chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra loại chỉ thị này ựược gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification = SRFA). Phương pháp linh hoạt này có thể phát hiện ựược sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào
- Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site Ờ Vị trắ ựược ựánh dấu bởi trình tự )
Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự ựề xuất năm 1989 (Olson et al, 1989) [87]. STS là một ựoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể ựược phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác ựịnh những vị trắ ựược ựánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide ựã biết trước của ADN trong genomẹ STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut ựã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR ựược thiết kế, theo trình tự ựoạn ựầu và ựoạn cuối của những locut ựặc trưng nàỵ Các ựoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tắnh ựặc hiệu cao với PCR. Phương pháp này dựa trên nguyên lý PCR nên dễ thực hiện, không tốn kém, hơn nữa lại sử dụng mồi ựặc hiệu nên kết quả ổn ựịnh. Nhược ựiểm của chỉ thị này là cần biết trình tự hai ựầu của các ựoạn mẫu dò mới có thể tiến hành ựược nghiên cứu, không có tắnh chất ựa hình như các chỉ thị phân tử khác, tần suất ựa hình thấp, thay ựổi ở mỗi locus và ở mỗi cặp lai cụ thể.
- Chỉ thị CAPs (Cleaved Amplification Polymorphisms - đa hình ựoạn nhân bội bị cắt giới hạn).
Chỉ thị này dựa trên ựa hình ựộ dài mảnh cắt giới hạn của các sản phẩm PCR (Javis et al, 1994; Konieczyn et al, 1993) [31], [37]. Những sản phẩm PCR từ STS, SCAR, RAPD nhiều khi không thể hiện ựa hình ựộ dài giữa hai mẫu thắ nghiệm ựược cắt bởi enzym giới hạn. Các enzym sử dụng trong việc tìm loại chỉ thị này thường enzym cắt 4. Sản phẩm cắt ựược phân giải trên gel agarose hoặc gel polyacrylamit tùy thuộc vào kắch thước của những mảnh cắt thu ựược.
1.3.1.4 Chỉ thị SSR (chỉ thị vi vệ tinh)
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite) ựược phát triển bởi Litt và Luty năm 1989. Vi vệ tinh là những ựoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những ựơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Vắ dụ:
NNNNNNN(GA)20-40NNNNNNNNN
NNNNNNN(CAT)16-26NNNNNNNNN
NNNNNNN(TTGG)12-18NNNNNNNNN
Chỉ thị SSR ựược nghiên cứu lần ựầu tiên trên người, sau ựó ựựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và Sebatian, 1998) [38].
Chỉ thị SSR là chỉ thị ựồng trội dựa trên các trình tự lặp lại ngắn. đây là loại chỉ thị ựang ựược sử dụng nhiều trong lập bản ựồ gen, trong nghiên cứu ựa dạng di truyền và chọn giống MAS.
Ưu ựiểm của chỉ thị SSR là tương ựối ựơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém. SSR là chỉ thị ựồng trội có khả năng phát hiện ựa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ ựặc trưng cho một loàị Tuy nhiên, SSR là một loại chắnh xác và hữu hiệu trong nghiên cứu ựa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi cây trồng khác nhau trong cùng một loài ựộng vật hay thực vật. Người ta sử dụng chỉ thị SSR ựể phân tắch hệ gen trong chọn giống, xây dựng bản ựồ liên kết gen, trong chọn lọc tắnh kháng bệnh, nghiên cứu một số tắnh trạng liên
quan ựến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân ựịnh sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép ựánh giá mức ựộ alen thuộc một locut (Caldo và Sebatian, 1998) [38].
1.3.1.5 Các loại chỉ thị phân tử khác
- Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog Ờ Vùng tương tự gen kháng)
- Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - đa hình của các nucleotit ựơn) SNP có những ưu ựiểm nổi bật sau:
+ SNP có tắnh chất ỘdiallelicỢ trong quần thể và tần suất alen của nó có thể ựược ước ựoán dễ dàng trong bất cứ quần thể nào, thông qua một loại xét nghiệm kỹ thuật.
+ SNP là những chỉ thị phân tử có tắnh ổn ựịnh rất cao về mặt di truyền.