1.4.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng ựể tạo ra cây ựơn bộị Số nhiễm sắc thể của cây ựơn bội ựược nhân ựôi ựể tạo ra cây lưỡng bội ựồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể ựơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ắch ựối với nhà chọn giống vì thể ựơn bội kép ựược sử dụng ựể làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết ựể tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương pháp ựơn bội kép ựược rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống (Grauda et al, 2010) [56]. Với cây lúa, nếu sử dụng nuôi cấy bao phấn thì thời gian chọn tạo một giống mới ựược rút ngắn từ 6 - 7 năm xuống còn 1 - 2 năm. Các dòng ựơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất ựể cải thiện hiệu quả chọn lọc ựối với nhiều tắnh trạng vì trong quần thể không có phương sai trội, ựồng thời gen lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Các dòng ựơn bội kép thu ựược sau khi nuôi cấy quần thể con lai F1, có thể sử dụng ựể lập bản ựồ gen (Anjali et al, 2007) [26].
Kỹ thuật này ựã ựược áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là: Khả năng nuôi cấy khó và tắnh ựặc thù cao của kiểu gen. Vắ dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica (Ronal et al, 1992) [94] do kiểu gen Indica khó nuôi cấy, hạt phấn còn
bị ảnh hưởng bởi giai ựoạn phát triển của bao phấn, ựiều kiện sinh lý của cây cho phấn, ựiều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, ựiều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine (Chowdhury et al, 2004) [46], (Javed et al, 2007) [64], (Xiaojia et al, 2006) [119].
Theo Yi Tang và cộng sự (2009) thì: hạt phấn ở giai ựoạn tiểu bào tử muộn cho tỷ lệ callus cao nhất và thấp nhất khi nuôi cấy hạt phấn ở giai ựoạn nhân ựôi (Yitang et al, 2009) [123]. Các nhà khoa học cho rằng khả năng hình thành callus bằng nuôi cấy bao phấn lúa có tắnh di truyền. Các tác giả cho rằng sự hình thành callus có khả năng là ựặc ựiểm di truyền lặn của một khối ựơn gen. Kiểu gen
japonica dường như hình thành cullus tốt hơn so với các bố mẹ khác (Rokhshana Khatun et al, 2010) [93]
Trong nuôi cấy bao phấn, tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu ựược tỷ lệ số cây ựơn bội khác nhau, có thể thu ựược các cây có mức ựộ bội thể caọ Các bao phấn dùng ựể nuôi cấy thường ựược lấy từ các cây của quần thể F1 nhằm tạo ra sự ựa dạng di truyền tối ựa trong quần thể các cây ựơn bội ựược tạo thành. Nhiễm sắc thể của cây ựơn bội từ nuôi cấy bao phấn, sau khi ựược lưỡng bội hoá, sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua ựánh giá chọn lọc và tạo ra giống mới (Supanyika Sengsai et al, 2007) [101].
Kiểu gen của cây cho bao phấn có ảnh hưởng rất lớn ựến kết quả nuôi cấy, không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong cùng một loàị Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một ựặc ựiểm có tắnh di truyền (Obert et al, 2004) [86].
Tala Gueye và Khadidiatou Ndoye Ndir (2010) ựã tiến hành thắ nghiệm: Nuôi cấy bao phấn của các kiểu gen lúa khác nhaụ Sau khi tiến hành thắ nghiệm, các tác giả cũng ựã rút ra kết luận: Khi nuôi cấy bao phấn lúa, các loài khác nhau có tỷ lệ hình thành callus và tái sinh cây xanh rất khác nhau (Swapan et al, 2005), [104], (Tala Gueye et al, 2010) [107].
Rokhshana Khatun và cộng sự (2010), ở Bangladesh, ựã tiến hành thắ nghiệm nuôi cấy bao phấn 25 dòng lúạ Các tác giả cũng ựã khẳng ựịnh: kiểu gen ựóng vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy [93].
Trong chương trình chọn tạo giống cây trồng, các dòng ựồng hợp tử ựóng vai trò rất quan trọng (Kang et al, 2008) [69]. Chúng là nguồn vật liệu khởi ựầu rất cần thiết trong công tác tạo giống. đối với những dòng tự thụ phấn, chúng ựồng thời cũng là sản phẩm cuối cùng của quy trình tạo giống.
Tác giả Wan và cộng sự năm 1985, ựã kiểm tra AND có chứa 5000 nuclei của mỗi dòng callus thấy rằng trong mỗi dòng callus ựều có cả tế bào ựơn bội và tế bào lưỡng bộị Các tế bào lưỡng bội này ựược hình thành do các tế bào ựơn bội ựã tự lưỡng bội hoá ở giai ựoạn trước hoặc giai ựoạn ựầu của tiểu bào tử. Tác giả ựã sử dụng 54 -58 chỉ thị phân tử ựể kiểm tra các tế bào lưỡng bội này thấy chúng hoàn toàn ựược hình thành từ một tiểu bào tử (hạt phấn) chứ không phải từ mô tế bào của cây F1 (vật liệu nuôi cấy bao phấn) (Wan et al, 1985) [115]. Như vậy cây ựơn bội kép (DH) nhận ựược trong nuôi cấy bao phấn là cây rất thuần vì có bộ nhiễm sắc thể ựược nhân ựôi từ bộ nhiễm sắc thể ựơn bộị Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy bao phấn, callus lưỡng bội cũng có thể ựược sinh ra từ tế bào vỏ bao phấn lưỡng bội (tế bào soma) cho nên sau này có thể tạo ra cây lưỡng bội có ựặc tắnh giống cây ựưa vào nuôi cấy bao phấn. Cây lưỡng bội thu ựược trong trường hợp này không có ý nghĩa khoa học. Chắnh vì vậy các nhà khoa học ựã sử dụng hàm lượng ựường cao (0,6%) trong môi trường tạo callus là ựể hạn chế không cho tế bào soma phát triển tạo thành callus. Trong quá trình nuôi cấy bao phấn thường xảy ra các ựột biến soma, Tần số ựột biến gen nhiều khi rất cao (10-2 Ờ 10-1 tắnh trên locus trên cây). Thay ựổi di truyền phổ biến nhất xảy ra trong tế bào nuôi cấy là ựa bội thể. Sau khi mô nuôi cấy nhân tế bào có thể trải qua quá trình nội phân (endoreduplication) làm số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào tăng lên gấp ựôi hoặc hơn nữa nhưng không xảy ra phân chia tế bàọ Kết quả số lượng nhiễm sắc thể của tế bào tăng lên, do vậy xuất hiện cây có hình thái dị thường (Masako et al, 1998 [69]. Chắnh vì thế mà quần thể cây tạo ựược thông qua nuôi cấy bao phấn thường gồm cả cây ựơn bội, cây lưỡng bội, cây tam bội, cây tứ bộị Nuôi cấy bao phấn chắnh là một phương pháp ựể tạo ra các dòng ựồng hợp tử trong quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền thống. Cây ựơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của quá trình nuôi cấy bao phấn. Chúng có ựặc ựiểm là ựồng hợp tử rất cao và ựược coi là nguồn vật liệu
ựa dạng, phong phú cho chọn giống (Nghiêm Như Vân và cộng sự, 2004) [19]. Các bao phấn dùng ựể nuôi cấy thường ựược lấy từ các cây lúa của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự di truyền tối ựa trong quần thể (Nguyễn Thị Lang và cộng sự, 2008) [6]. Hiệu quả của quá trình nuôi cấy bao phấn lúa phụ thuộc nhiều yếu tố: Kiểu gen của cây ựưa vào nuôi cấy, yếu tố môi trường: Nhiệt ựộ, ánh sáng, thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy và các kỹ thuật xử lý trước và sau khi nuôi cấy bao phấn (đào Thị Hải Lý và cộng sự, 2007) [8], (Soliman et al, 2007) [90].
Nhiều nước trên thế giới ựã sử dụng rất thành công phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa trong chọn tạo giống mớị Ở Trung Quốc, một lượng lớn các giống lúa mới ựược tạo ra nhờ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa và ựược trồng trên diện tắch hàng nghìn hạ Ở Hàn Quốc, chọn giống nhờ công nghệ ựơn bội ựược ựưa vào chương trình chọn giống quốc gia năm 1977, chỉ trong 7 năm 4 giống lúa ựã ựược tạo ra (Gioi et al, 2002) [55], (Moon et al, 2001) [81]. Các nhà khoa học Philippin ựã sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn ựể cải tạo và tạo ra rất nhiều giống lúa cho năng suất cao, chất lượng gạo tốt và mang các gen kháng như: Kháng bệnh bạc lá, ựạo ôn, rầy nâụ..(Chen et al, 2002) [42]. So sánh với phương pháp chọn giống truyền thống các tác giả cũng ựã khẳng ựịnh chọn giống bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn chỉ mất có 3 năm trong khi chọn giống theo phương pháp truyền thống phải mất 6 - 7 năm (Victoria et al, 2004) [112]. Các nhà khoa học Nhật Bản cũng sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa Japonica có ựộ dẻo caọ Họ còn sử dụng phương pháp này ựể nuôi cấy các dòng lúa ựã ựược chuyển gen. Kết quả thu ựược gồm cả cây ựơn bội và cây ựơn bội kép mang gen chuyển (McXouch et al, 1998) [79]. Các nhà khoa học Mexico ựã cải tạo chất lượng gạo của giống MA92 (Indica) bằng cách cho lai MA92 với giống Kois (Japonica) và ựến thế hệ F4 ựưa vào nuôi cấy bao phấn (Alma et al, 2005) [23].
Các nhà khoa học Thái Lan ựã sử dụng kết hợp thành công MAS và phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa ựể quy tụ gen kháng vi khuẩn bạc lá (Xa21) trên nhiễm sắc thể số 11 và gen chịu úng (SUB trên nhiễm sắc thể số 9) vào giống lúa chất lượng KDML 105 (Khoa Dok Mali). Tương tự họ cũng kết hợp MAS và nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa chất lượng kháng bệnh ựạo ôn (Jiang et al, 2004) ...
Như vậy nếu sử dụng MAS kết hợp nuôi cấy bao phấn sẽ tiết kiệm ựược thời gian, nhân công và tiền bạc trong việc chọn tạo giống lúa mớị
1.4.2.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cấy bao phấn cho kết quả rất tốt. Năm 1976, tại Viện Công nghệ sinh học Việt Nam ựã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy bao phấn và thu ựược kết quả ban ựầụ Kỹ thuật này cũng ựược nghiên cứu và ứng dụng thành công ở những cơ quan như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Cây Lương thực, Viện Lúa đồng bằng Sông Cửu Long.... (đặng Minh Tâm và cộng sự, 2004) [16]
Năm 1997, các nhà nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp cải tiến quy trình nuôi cấy bao phấn mớị Quy trình này cho phép nâng cao tỷ lệ tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây xanh lưỡng bội (Phạm Ngọc Lương và cộng sự, 1999) [7]
Tác giả đào Hải Lý và cộng sự ựã tiến hành thắ nghiệm nuôi cấy bao phấn 3 tổ hợp lai F1 5B, 6B, 7B, xử lý lạnh 2, 4, 6 ngàỵ Tác giả nhận xét thấy bao phấn ựược sử lý lạnh 2 - 4 ngày cho phản ứng tốt hơn với môi trường nuôi cấỵ Tác giả cũng ựưa ra kết luận rằng: Nguồn gen khác nhau sẽ cho phản ứng khác nhau với môi trường nuôi cấy bao phấn (đào Thị Hải Lý và cộng sự, 2007) [8]
Từ năm 1994 ựến nay, nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn lúa ựể chọn tạo giống lúa mớị Bằng phương pháp lai tắch luỹ kết hợp với nuôi cấy bao phấn người ta ựã có thể cùng một lúc chọn ựược nhiều tắnh trạng khác nhau như: dòng chất lượng cao, chịu mặn, chịu hạn, chịu rét (Nghiêm Như Vân và cộng sự, 2004) [19] Ầựể tạo nguồn vật liệu mới sử dụng trong chọn tạo giống. Tác giả Nguyễn Thị Lang và cộng sự tại Viện lúa đồng bằng Sông Cửu Long ựã tiến hành nuôi cấy 3 tổ hợp lai: C53/Pokkali, C53/ựốc Phụng, C53/C51 trên môi trường N6. Tác giả thu ựược 72 dòng lúa ựơn bội kép. Qua ựánh giá khả năng chịu mặn và ựánh giá bằng chỉ thị phân tử SSR (RM 223), tác giả ựã chọn ựược 11 dòng triển vọng cho năng suất cá thể cao và có ựặc tắnh nông sinh học tốt ựặc biệt là có khả năng chịu mặn (Nguyễn Thị Lang và cộng sự, 2008) [6]. Năm 2004, Trần đình Giỏi và Vương đình Tuấn ựã lai giống lúa IR64 với các giống lúa mới (new plant type), IR69146-15, IR69146-25, IR68530, IR70441. Tổ hợp lai IR64/IR69146-25 cho tỷ lệ callus cao
nhất (8,85%). Tác giả khẳng ựịnh môi trường N6 có bổ sung 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA cho tỷ lệ cây tái sinh cao nhất (5,29%) (Gioi et al, 2002) [55]
Bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn các tổ hợp lai F1, các nhà khoa học Việt Nam ựã tạo ra nhiều dòng ựơn bội kép cho năng suất cao, chất lượng tốt như giống lúa: OM 3007-16-37, OM 3007-42-94, giống lúa AC5 (Viện cây lương thực), Giống lúa SL12 (Viện Di truyền Nông nghiệp), giống lúa VH1, VH2 của viện Công nghệ sinh học), giống lúa Pđ211 (Nguyễn Tấn Hinh và cộng sự, 2005) [9], (Tien et al, 2003) [109], (Van et al, 2004) [110]Ầ
Tóm lại: Sử dụng những thành tựu khoa học sinh học phân tử của thế giới, kết hợp phương pháp chỉ thị phân tử, nuôi cấy bao phấn và lai truyền thống, chúng ta hoàn toàn có thể lai quy tụ gen kháng bệnh bạc lá vào các giống lúa năng suất cao bị nhiễm bệnh bạc lá ựể tạo giống lúa kháng bệnh.
Căn cứ vào yêu cầu thực tiễn và những thành tựu ựã ựạt ựược trên thế giới, chúng tôi ựã lựa chọn ựề tài và phương pháp nghiên cứu phù hợp.
Chương 2