VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2 Phương pháp chỉ thị phân tử
địa ựiểm nghiên cứu tại bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp, thời gian nghiên cứu 2006 Ờ 2010. Vật liệu là các dòng, giống thu thập và toàn bộ các cá thể lai, các dòng ựơn bội kép thu ựược từ các tổ hợp lai giữa giống lúa MT508-1 và các dòng NILs.
Sử dụng các chỉ thị phân tử PCR-based liên kết gần với các locus gen ựã biết ựể xác ựịnh các dòng mang gen kháng vi khuẩn bạc lá trong quần thể con laị
ạ Phương pháp tách chiết ADN: ADN tổng số ựược tách chiết theo phương pháp "NaOH extraction" của Wang (1992). Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước:
- Mẫu lá non ựược cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml. Thêm 200ộl NaOH 0.25N. Nghiền mịn mẫu lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM 200. Thêm 800ộl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trộn ựềụ
- Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 20 phút. Chuyển 200ộl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml. Lưu giữ ở -200C ựể làm dung dịch ADN gốc. Pha loãng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5ộl dung dịch ADN pha loãng cho mỗi phản ứng PCR
b. Kỹ thuật PCR: Phản ứng PCR ựược tiến hành trên máy Veriti 96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15 ộl bao gồm 5ộl ADN, 0.15ộM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch ựệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.25 ựơn vị Taq TaKaRạ điều kiện phản ứng PCR như sau: 950C - 7 phút; 35 chu kỳ của: 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 5 phút; giữ mẫu ở 40C. Sản phẩm PCR ựược phân giải trên gel agarose 3%.
c. Phương pháp ựiện di trên gel agarose
Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến.
Chuẩn bị gel agarose:
- Bột Agarose ựược hòa tan trong dung dịch ựệm TBE 0.5X với nồng ựộ 3,0%. - đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng.
- Hạ nhiệt ựộ của gel agarose xuống khoảng 500C.
- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng ựộ 0.5ộg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lược.
- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel ựông là 45 - 60 phút.
- Tra sản phẩm PCR.
- Chuẩn bị dung dịch ựệm TBE 0.5X cho vào bể chạy ựiện di - Chạy ựiện di tại 100mA trong 4 giờ.
- Rửa gel trong nước, ựặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.