C. dài P.ứng dài P.ứng dài P.ứng
F1.5 F1.7 F5/7 BC1.62 BC2.62 BC3
Số bao phấn 1980 3420 5880 7890 11250 19290
Số callus 113 157 300 300 304 405
Tỷ lệ (%) 5,7 4,6 5,1 3,8 2,7 2,1
Cây tái sinh 48 96 148 137 124 152
Tỷ lệ (%) 42,4 61,1 49,3 45,7 40,8 37,5
Cây xanh tái sinh 26 52 68 64 49 56
Tỷ lệ (%) 23 33,1 22,7 21,3 16,1 13,8
Cây bạch tạng 22 44 80 73 75 96
Tỷ lệ (%) 19,5 28,0 26,7 24,3 24,7 23,7
Số liệu ở bảng 3.12 cho thấy tỷ lệ tạo callus thu ựược ở các tổ hợp lai F1 (4,6 - 5,7%) cao hơn so với tỷ lệ callus thu ựược ở các thế hệ BC1F1 (3,8%), BC2F1 (2,7%)
và BC3F1 (2,1%). So sánh giữa các thế hệ BC1F1, BC2F1, BC3F1 ta thấy tỷ lệ này giảm dần và thấp nhất ở thế hệ BC3F1. Quan sát tỷ lệ cây tái sinh và tỷ lệ cây xanh tái sinh ta cũng thấy ựiều ựó. Tỷ lệ cây xanh tái sinh ở tổ hợp lai F1 cao nhất (33,1%) và thấp nhất ở thế hệ BC3F1 (13,8%).
Hình 3.13: Callus hình thành ở môi trường N6 (tổ hợp lai F1.5) và cây xanh tái sinh ở môi trường MS (tổ hợp lai F1.7)
Rõ ràng là phản ứng của các hạt phấn F1 với môi trường nuôi cấy bao phấn tốt hơn hạt phấn ở các thế hệ lai trở lạị Callus thu ựược từ cây F1 cũng cho tỷ lệ cây tái sinh cao hơn callus thu ựược từ các cây BC1F1, BC2F1, BC3F1. Kết quả nghiên cứu của ựề tài cũng trùng với kết quả của nhiều nghiên cứu trước. Các tác giả thường sử dụng bao phấn của các cây F1 ựể nuôi cấy vì tỷ lệ dị hợp tử trong các cá thể lai F1 là tối ựa nên phản ứng của các hạt phấn và callus trong môi trường nuôi cấy bao phấn tốt hơn, xuất hiện sự ựa dạng di truyền tối ựa trong quần thể các cây ựơn bội kép ựược tạo thành (Masako, 1998)[69], (Natalija, 2006)[93]
Như vậy tỷ lệ dị hợp tử giảm dần qua các thế hệ BC1F1, BC2F1, BC3F1 ựã ảnh hưởng ựến tỷ lệ hình thành callus và tỷ lệ cây tái sinh và tỷ lệ cây xanh tái sinh.
Trong nuôi cấy bao phấn lúa, ựặc biệt với giống lúa Indica thì ựiều các nhà chọn giống quan tâm nhất là tỷ lệ cây xanh tái sinh và tỷ lệ hình thành cây bạch tạng. Tỷ lệ tạo cây bạch tạng, khi nuôi cấy bao phấn của nhóm cây ngũ cốc: lúa, lúa mạch, lúa mỳ rất cao ựặc biệt ở giống lúa indica. Những cây bạch tạng này (hình 3.14) không tồn tại trong tự nhiên và không có giá trị nông học. Vì vậy ựể sử dụng có hiệu quả kỹ
thuật nuôi cấy bao phấn, ựiều quan trọng là phải tìm ra nguyên nhân của sự hình thành cây bạch tạng và tìm ra giải pháp khắc phục ựiểm nàỵ Tỷ lệ cây bạch tạng thu ựược trong thắ nghiệm dao ựộng từ 19,5% - 28%. Tỷ lệ này so với kết quả của các tác giả khác là không caọ Tỷ lệ này có thể ựạt tới 99% trong nuôi cấy bao phấn lúạ Sự hình thành cây bạch tạng có thể còn do ựột biến hoặc do sự biểu hiện của gen lặn (Baenziger, 1996)[30]. Nhiều tác giả cho rằng nguyên nhân gây ra tỷ lệ cây bạch tạng cao là do nhiệt ựộ khi nuôi cấy, giai ựoạn lấy ựòng....Theo nghiên cứu của chúng tôi, kết quả ựã ựược công bố trên tạp chắ chuyên nghành, thì thời gian cấy chuyển callus ảnh hưởng rất lớn ựến sự hình thành cây bạch tạng. Khi callus hình thành ựược khoảng 1 tuần ựến 10 ngày nên chuyển callus sang môi trường tái sinh cây sẽ hạn chế hình thành cây bạch tạng.
Hình 3.14: Cây bạch tạng thu ựược trong thắ nghiệm
3.2.3.2 Tỷ lệ cây xanh ựơn bội kép và cây xanh dị bội thu ựược trong thắ nghiệm
Các callus ựược tạo thành ban ựầu bao gồm các tế bào ựơn bội, sau ựó tuỳ ựiều kiện nuôi cấy chúng có thể là ựơn bội hay tự lưỡng bội hoá trong môi trường nuôi cấỵ Khi chuyển callus vào môi trường tái sinh, callus sẽ phát triển hình thành cây ựơn bội hoặc cây ựơn bội kép (DH). Tỷ lệ cây ựơn bội kép sẽ quyết ựịnh sự thành công của quá trình nuôi cấy bao phấn lúạ
trong nuôi cấy bao phấn là cây có bộ nhiễm sắc thể ựược nhân ựôi từ bộ nhiễm sắc thể ựơn bộị Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy bao phấn, callus lưỡng bội cũng có thể ựược sinh ra từ tế bào vỏ bao phấn lưỡng bội (tế bào soma). Trong nuôi cấy bao phấn còn xảy ra các ựột biến soma, chắnh vì thế mà quần thể cây xanh thu ựược thông qua nuôi cấy bao phấn thường gồm cả cây ựơn bội, cây ựơn bội kép, cây lưỡng bội, cây tam bội, cây tứ bộị
Qua quan sát và kiểm tra các cây xanh thu ựược trong thắ nghiệm nhận thấy: - Cây lưỡng bội ựược sinh ra từ tế bào vỏ bao phấn sẽ bị phân ly ở thế hệ sau khi cho tự thụ vì cây ựưa vào nuôi cấy bao phấn lúa là cây laị
- Cây ựơn bội kép (DH) là cây khi cho tự thụ, thế hệ sau sẽ thuần và mang những ựặc tắnh của cả dòng bố và dòng mẹ.
- Cây ựơn bội thì hình dáng cây rất thấp, hạt rất nhỏ và bị lép - Cây tam bội thì dáng cây cao, hạt to có râu nhưng không kết hạt
- Cây tứ bội có bộ lá to, khoẻ, cây cao hạt rất to và cây kết hạt bình thường, khi lai với giống lúa ngoài sản xuất sẽ cho con lai bất dục. (Quan sát hình 3.15).
Hình 3.15: Các dạng cây xanh tái sinh thu ựược trong nuôi cấy bao phấn lúa
Sau khi tiến hành nuôi cấy bao phấn các cây lai mang gen kháng, số liệu thống kê (tỷ lệ %) của các cây xanh tái sinh (Tỷ lệ cây DH, Cây ựơn bội, cây lưỡng bội, cây dị bội ựược so với tổng số cây tái sinh thu ựược trong thắ nghiệm) ựược trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13: Số liệu về cây xanh tái sinh thu ựược
Vật liệu
Kết quả nuôi cấy F1.5 F1.7 F5/7 BC1.62 BC2.62 BC3.62
Tổng số
Cây tái sinh 48 96 148 137 124 152 705
Cây ựơn bội kép 9 14 21 20 17 19 100
Tỷ lệ (% ) 18,7 14,6 14,2 14,6 13,7 12,5 14,1
Cây lưỡng bội 0 1 0 3 0 1 5
Tỷ lệ (% ) 0 2 0 2,2 0 0,6 0,7
Cây ựơn bội 15 36 45 41 31 33 201
Tỷ lệ (% ) 31,2 37,5 30,4 29,9 25,0 21,7 28,5
Cây tam bội 2 0 1 0 1 2 6
Tỷ lệ (% ) 4,1 0 0,6 0 0,8 2,4 0,8
Cây tứ bội 0 1 1 0 0 1 3
Tỷ lệ (% ) 0 1,0 0,7 0 0 0.6 0,4
Kết quả ở bảng số liệu 3.13 cho thấy tỷ lệ cây lưỡng bội rất thấp (0,7%)l. Tỷ lệ cây tam bội và tứ bội cũng không ựáng kể (tỷ lệ chung là 0,8 %), ở một số tổ hợp thậm chắ còn không xuất hiện. Theo Masako và cộng sự, 1998 [69] thì tần số ựột biến lớn nhất có thể xuất hiện trong nuôi cấy bao phấn là khoảng 10-2. Tỷ lệ cây ựơn bội thu ựược trong thắ nghiệm khá cao từ 21,7% ựến 37,5%. Nếu so với số cây xanh tái sinh thu ựược thì tỷ lệ cây ựơn bội thu ựược trong thắ nghiệm là 63,5%. Tỷ lệ này cao hơn một chút so với kết quả của Zeng và công sự, 2002 [132]. Các tác giả ựã nuôi cấy 2600 bao phấn của dòng phục hồi Minghui 81và thu ựược 40 cây ựơn bội (chiếm 48%) trong tổng số 83 cây xanh tái sinh thu ựược. Cấy chuyển nhiều lần trong môi trường nhân cây cũng là một trong những nguyên nhân dẫn ựến tỷ lệ cây ựơn bội caọ Ta có thể thu ựược cây lưỡng bội khi gây lưỡng bội bộ NST của cây ựơn bội bằng Colchicinẹ
Tỷ lệ cây DH thu ựược mới là ựiều quan tâm nhất trong thắ nghiệm nuôi cấy bao phấn lúạ Những cây DH này hoàn toàn ựược hình thành từ một tiểu bào tử (hạt phấn) chứ không phải từ mô tế bào của cây lai (Wan et al, 1985) [115]. Bởi vậy cây ựơn bội kép (DH) nhận ựược trong nuôi cấy bao phấn là cây rất thuần vì có bộ nhiễm sắc thể ựược nhân ựôi từ bộ nhiễm sắc thể ựơn bộị Các cây DH này nếu mang gen kháng bệnh bạc lá sẽ là các dòng vật liệu quý trong chọn tạo giống lúa mới kháng
bệnh. Trong thắ nghiệm trên thì tỷ lệ cây DH thu ựược là 12,5% ựến 18,7%. Quan sát số liệu ở bảng ta có thể thấy tỷ lệ cây DH thu ựược khi nuôi cấy bao phấn lúa thế hệ F1 và BC1F1 là cao hơn cả (18,7% và 14,6% ) và tỷ lệ này giảm dần khi nuôi cấy bao phấn lúa các thế hệ tiếp theo BC2F1 (13,7% ) và BC3F1 (12,5%). đây có thể là một trong những lý do vì sao nhiều nhà khoa học thường sử dụng nguồn vật liệu trong nuôi cấy bao phấn là các quần thể lai F1.
Trong số những cây DH thu ựược có cây mang những ựặc tắnh của bố hoặc mẹ nhưng cũng có cây lại có những ựặc tắnh không mong muốn do vậy tùy mục ựắch của người sử dụng mà ta giữ lại những cây có thể chọn làm vật liệu nghiên cứụ
Tóm lại: Khi nuôi cấy bao phấn các tổ hợp lai giữa dòng MT508-1 với các dòng mang gen kháng bệnh bạc lá thì hiệu quả nuôi cấy bao phấn con lai F1, BC1F1 cao hơn con lai BC2F1 và BC3F1. Càng lai lại nhiều lần thì tỷ lệ callus, tỷ lệ cây tái sinh và tỷ lệ cây xanh tái sinh càng giảm.
3.3 đánh giá các dòng ựơn bội kép thu ựược, xác ựịnh tập ựoàn vật liệu mang gen kháng bệnh bạc lá lúa: xa5, Xa7, Xa21 và chọn lọc các dòng lúa triển vọng