VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5 Nuôi cấy bao phấn con lai ựã ựược chuyển gen
Sử dụng Phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa cải tiến của Viện Di truyền Nông nghiệp:
Môi trường nuôi cấy: Sử dụng 2 loại môi trường cơ bản là N6 (Chu et al 1978), MS (Murashige & Skoog 1962).
đặc ựiểm nuôi cấy * Tạo mô sẹo trong tối
* Tái sinh cây xanh ở ựiều kiện chiếu sáng: 4000 - 5000 lux * Thời gian chiếu sáng 13 - 14 giờ/ngày
* Nhiệt ựộ phòng chiếu sáng 22 - 240C * độ ẩm phòng 50 - 70%
ạ Phương pháp lẫy mẫu nghiên cứụ
Mỗi tổ hợp lúa lấy khoảng 20 ựòng ở giai ựoạn tiểu bào tử (một nhân), chọn những ựòng chắnh ựạt tiêu chuẩn ở các khóm lúa khác nhau, cho vào túi nilông sạch, ựeo thẻ ghi tên, ghi ngày lấy ựòng.
b. Phương pháp xử lý mẫu trước khi cấỵ
Khi mẫu ựược lấy ở ngoài ựồng về, ựòng ựược cắt bớt lá ựòng cho gọn, dùng bông thấm nước tẩm cồn 900 lau sạch ựể khử trùng sơ bộ, cho ựòng vào túi ni lông sạch, buộc chặt miệng túi rồi ựưa vào xử lý lạnh 8 - 100C trong 1 tuần.
c. Phương pháp khử trùng môi trường trước khi nuôi cấỵ
Sau khi pha chế xong, môi trường ựược ựổ vào ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm chứa 10 - 15 ml môi trường. đậy nút bông ựã khử trùng và ựược sấy khô, ựậy nắp giấy cho mỗi ống nghiệm và cho vào nồi khử trùng với áp suất 1,1 atm trong 20 phút
d. Phương pháp lấy bao phấn ựưa vào môi trường nuôi cấỵ
Sau khi ựã khử trùng lần cuối trong tủ cấy vô trùng bằng cồn 700, tiến hành bóc bẹ lá bao bên ngoài ựòng, cắt hoa lúa vào ựĩa petri rồi ựậy kắn lạị Dùng panh gắp hoa lúa trong ựĩa petri lên, lấy kéo cắt bỏ phắa dưới của vỏ trấu, sau ựó dùng kéo gõ nhẹ vào môi trường trong ống nghiệm. Mỗi ống nghiệm khoảng 30 bao phấn.
+ Mỗi thắ nghiệm ựược thực hiện với 3 lần nhắc lại
+ đánh giá hiệu quả nuôi cấy bao phấn lúa thông qua tỷ lệ tạo callus (%), Tỷ lệ cây tái sinh (%), Tỷ lệ cây bạch tạng (%), Tỷ lệ cây ựơn bội kép (%). Tỷ lệ cây xanh tái sinh (%), Tỷ lệ cây dị bội (%)...
∑ callus tạo thành Tần suất tạo callus (%) =
∑ bao phấn x 100
∑ cây tái sinh Tần suất tái sinh cây (%) =
∑ callus tạo thành x 100
∑ cây xanh tái sinh Tần suất tái sinh cây xanh (%) =
∑ callus tạo thành x 100
∑ cây bạch tạng Tần suất tạo cây bạch tạng (%) =
∑ callus tạo thành x 100
∑ cây ựơn bội kép Tần suất tái sinh cây ựơn bội kép (%) =
∑ cây tái sinh tạo thành x 100
∑ cây ựơn bội Tần suất tái sinh cây ựơn bội (%) =
∑ cây tái sinh tạo thành x 100
∑ cây tam bội Tần suất tái sinh cây tam bội (%) =
∑ cây tái sinh tạo thành x 100
∑ cây tứ bội Tần suất tái sinh cây tứ bội (%) =
∑ cây lưỡng bội Tần suất tái sinh cây lưỡng bội (%) =
∑ cây tái sinh tạo thành x 100