1.3.2.1 Phân tắch ựa dạng di truyền
Sự ra ựời của các loại chỉ thị phân tử (CTPT) ựã cung cấp cho các nhà khoa học một công cụ hữu ắch trong việc nghiên cứu di truyền thực vật nói chung cũng như trong nghiên cứu ựa dạng di truyền, chọn tạo giống thực vật nói riêng. Ưu ựiểm của chỉ thị di truyền trong phân tắch ựa dạng di truyền là rút ngắn thời gian nghiên cứu, thời gian chọn lọc ựối với các tắnh trạng không hoặc khó ựánh giá thông qua kiểu hình. Các chỉ thị phân tử thường ựược sử dụng ựể nghiên cứu, xác ựịnh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loàị
Những kỹ thuật phân tử khác nhau ựã và ựang ựược ứng dụng trong nghiên cứu ựa hình ADN như: kỹ thuật ựa hình ựộ dài mảnh phân cắt giới hạn (RFLP), ựa hình AND nhân bội ngẫu nhiên (RAPD) và vi vệ tinh, gần ựây là ựa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn ựược nhân bội (AFLP).
Tại Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về da dạng di truyền trên ựối tượng nấm ựạo ôn lúa, sử dụng kỹ thuật Pot2-Rep PCR, RGA, RAPD (Trần Duy Dương và cộng sự, 1999)[5], (Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự, 1999)[11]. Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long ựã tiến hành phân tắch ựa dạng di truyền của 90 giống lúa mùa ựịa
phương (những giống lúa thơm ở Việt Nam có năng suất cao) bằng phương pháp phân tử và phương pháp ựánh giá hình thái, ựồng thời phân tắch mối tương quan giữa các tắnh trạng ựể áp dụng cho việc chọn giống (Phạm Thị Bé và cộng sự, 2008) [1]
Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa lai có thể xác ựịnh chắnh xác sự ựa dạng di truyền của các vật liệu, ựồng thời giúp các nhà chọn giống lựa chọn cặp bố, mẹ của tổ hợp lai cho ưu thế lai cao thay vì phải lai hàng ngàn cặp rồi ựánh giá chọn lọc, lai thử lại, ựánh giá và khảo nghiệm ựể tìm ra tổ hợp mong muốn theo phương pháp truyền thống.
Tóm lại, CTPT ựã và ựang ựược các nhà khoa học trong nước cũng như ở nước ngoài sử dụng như một công cụ hữu ắch trong nghiên cứu ựa dạng di truyền.
1.3.2.2 Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản ựồ gen
Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị tốt cho nghiên cứu lập bản ựồ liên kết gen, ựặc biệt ựối với trường hợp các chỉ thị RFLP, STS và SSR ựã ựược xác ựịnh vị trắ trên NST. Vì vậy khi sử dụng chúng trong nghiên cứu sẽ cho biết vị trắ của gen liên kết nằm trên NST nào của ựối tượng.
Bản ựồ di truyền lúa ựầu tiên ựược thiết lập bởi Nagao và Takashuki năm 1963, gồm 12 nhóm liên kết. Vào những năm 70 của thế kỷ XX, nhiều nhà di truyền chọn giống ựã ựề xuất bản ựồ di truyền của lúa thiết lập nhờ các thể ba (trisomic). Sau ựó bản ựồ di truyền liên kết ở lúa ựược thiết lập trên cơ sở các chỉ thị ựột biến hình thái và các chỉ thị izozym. Bản ựồ di truyền lúa thứ hai do các nhà nghiên cứu Nhật Bản (thuộc chương trình Rice Genome Project) thiết kế gồm trên 3.000 chỉ thị, chủ yếu là các chỉ thị RFLP từ các dòng ADN hệ gen và ADN bổ trợ (cDNA) (Caldo et al, 1998) [38].
Cùng với sự ra ựời của chỉ thị phân tử là sự xuất hiện của những phương pháp toán xác suất thống kê trên cơ sở chỉ thị phân tử ựể lập bản ựồ QTL. Cùng với sự hỗ trợ của các chương trình máy tắnh như: chương trình ỘMapMakerỢ, ỘJoinMapỢ, các kỹ thuật chỉ thị phân tử ựã cho phép lập bản ựồ hàng loạt các gen và các lôcut kiểm soát các tắnh trạng số lượng có ý nghĩa nông học ở cây trồng và vật nuôi (Yan et al, 2009) [39].
Nhờ chỉ thị phân tử, người ta ựã lập ựược bản ựồ gen kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, ựạo ôn ở lúạ.. Các gen bất dục ựực nhân mẫn cảm với nhiệt ựộ cũng ựã ựược lập bản ựồ như: tms2 (Trung Quôc) nằm trên NST số 7 của lúa, tms3 (IRRI) nằm trên NST , tms4 (Việt Nam) nằm trên nhiễm sắc thể số 2, tms5 (Ấn độ) nằm trên nhiễm sắc thể số 9Ầ(Dong et al, 2000) [53]. Gần ựây, 2008, các nhà khoa học ựã thành công trong việc lập bản ựồ 2 gen bất dục phản ứng với quang chu kỳ rpms1và rpms2) ở lúa ( Peng et al, 2008) [88].
Với sự thuận lợi của những chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật PCR, chúng ta ựã giảm rất nhiều chi phắ nghiên cứu so với sử dụng RFLP. Tuy nhiên ựể chọn lựa chỉ thị nào liên kết với một gen kháng bệnh, thì trước tiên bản ựồ di truyền của gen ựó phải ựược thiết lập. Chắnh vì vậy lập bản ựồ gen rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúạ
1.3.2.3 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (-Assisted Selection - MAS)
Từ lâu, các nhà chọn giống ựã quan tâm ựến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tắnh trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ắch trong quy trình tạo giống mớị Với chỉ thị hình thái các nhà chọn giống phải ựánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn. Mặt khác, chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều còn những chỉ thị may mắn (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ CTPT các nhà chọn giống bắt ựầu quan tâm ựến vấn ựề Ộchọn giống nhờ chỉ thị phân tửỢ (-Assisted Selection) (MAS) với ý ựồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới (Chen et al, 2000) [40].
Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta ựưa nguồn gen mới có tắnh trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua nhiều thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 ựến các thế hệ tiếp theọ Mỗi gen chắnh thường chỉ kháng ựược với 1 chủng gây bệnh hoặc chủng gây hại nào ựó, do vậy nếu quy tụ ựược vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra ựược 1 dòng lúa kháng ựược với nhiều chủng gây
bệnh hoặc nhiều chủng gây hạị Như vậy muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững ựối với dịch hại, người ta phải ựưa ựược vài gen kháng hiệu quả cao vào Ộgenom ựắchỢ. Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc ựưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc cùng một lúc chuyển vài gen mong muốn vào Ộgenom ựắchỢ (quy tụ nhiều gen vào 1 giống ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc ựôi khi không thể thực hiện ựược. Còn ựối với quy trình MAS, thay vì ựánh giá kiểu hình các cá thể con lai ựể chọn ra cá thể mang gen mới chuyển, người ta xác ựịnh các cá thể mang gen mới một cách gián tiếp, thông qua chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen ựó (Chen et al, 2000) [40].
Bert Collard & David Mackill khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử ( assisted selection- MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với locus mục tiêu ựể thay cho chọn lọc ựánh giá kiểu hình. Giả ựịnh rằng chỉ thị ADN (ADN s) có thể dự ựoán kiểu hình một cách ựáng tin cậy
Bert Collard & David Mackill, 2006 cho rằng MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu ựiểm nổi bật là:
+ đặc biệt với những tắnh trạng khó ựánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình
+ Có thể tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc
+ Rất quan trọng với một số tắnh trạng như chất lượng hạt
+ Có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3
+ Không bị ảnh hưởng của môi trường
+ Có thể phân biệt giữa ựồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây Theo IRRI có 4 phương pháp tiếp cận MAS
+ Lai lại dựa trên chỉ thị phân tử (-assisted backcrossing)
+ Quy tụ gen (Pyramiding)
+ Chọn lọc những thế hệ ựầu (Early generation selection)
+ Tiếp cận phối hợp ( ỔCombinedỖ approaches)
3 mục ựắch: Phát hiện gen quan tâm (trội hay lặn) trong các quần thể; nhận dạng nhanh các cá thể phù hợp nhất trong các quần thể dựa trên thành phần của gen hay toàn bộ genome; chuyển một vùng gen, ựối với những tắnh trạng quan tâm ựược quy ựinh bởi ựơn gen hay bởi một gen chịu trách nhiệm phần lớn việc biểu hiện kiểu hình của tắnh trạng. Phá vỡ khả năng liên kết của gen quan tâm với các locut không mong muốn.
Koebner (2003) [68] ựã có một bài tổng quan về các thành tựu chọn giống nhờ chỉ thị phân tử ựối với tắnh kháng sâu, bệnh và cải tiến một số ựặc ựiểm nông sinh học ở lúa mì, lúa mạch, ngô và lúạ MAS tỏ ra có hiệu quả ựối với các tắnh trạng ựơn giản ựược ựiều khiển bởi một số lượng hạn chế các gen như các tắnh kháng sâu, bệnh. đến nay, nhiều chương trình trong chiến lược chọn giống bằng MAS ở lúa tập trung vào quy tụ gen kháng bệnh: bạc lá, rầy nâu, ựạo ôn ...(Koebner et al, 2003) [68].
Trong những năm gần ựây, một vài mô hình MAS ựã ựược các nhà khoa học ựưa ra và phân tắch cặn kẽ. Theo một số mô hình thì chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần ựến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn giống có kắch thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế.
Trong một số trường hợp thuận lợi, ựôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể ựạt ựược mục tiêu của mình. Hơn thế nữa, Frisch và ctv. (1999) ựã thiết kế chiến lược Ộchọn giống 2 giai ựoạnỢ ựể áp dụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản ựồ liên kết của các chỉ thị phân tử. điều này chứng tỏ công nghệ chỉ thị phân tử có một lợi thế lớn khi ứng dụng trong chương trình chọn giống ngay cả khi tài nguyên chọn giống bị hạn chế. Như vậy chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, khi phối hợp với chọn giống truyền thống, tỏ ra rất hiệu quả, tiết kiệm công sức và rút ngắn ựáng kể thời gian tạo giống (Chen et al, 2000) [40].
1.3.2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh bạc lá 1.3.2.4.1 Nghiên cứu chọn, tạo giống kháng bệnh bạc lá trên thế giới
Từ các nghiên cứu trên cho thấy, tắnh kháng bệnh bạc lá là do gen quy ựịnh nên trên cơ sở ựó chọn lọc các cặp bố mẹ và bằng phương pháp lai hữu tắnh kết hợp với chỉ thị phân tử chúng ta có thể tạo ựược giống kháng bệnh. Bằng phương pháp
này có thể tạo ựược những giống lúa mới vừa kết hợp ựược những ựặc tắnh nông sinh học tốt của bố mẹ vừa mang gen kháng bệnh bạc lá.
Ở Nhật Bản bệnh bạc lá gây hại từ năm 1884 nhưng mãi ựến năm 1926 cây lúa kháng bệnh bạc lá ựầu tiên mới ựược xác ựịnh. Cây lúa kháng bệnh này ựược chọn ra từ giống lúa nhiễm bệnh, ựược ựặt tên là Kono 35. Giống này cung cấp gen chống chịu cho nhiều giống lúa ở Nhật Bản (Lê Lương Tề và cộng sự, 2007) [13].
Ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế, chương trình chọn giống kháng bệnh bạc lá ựã ựạt ựược nhiều kết quả. Người ta ựã ựưa ra nhiều dòng, giống kháng bệnh và chúng ựược trồng rộng rãi ở Châu Á, cung cấp vật liệu kháng bệnh bạc lá cho các nước như Philippin, Trung Quốc, Ấn độ, Nepal, Bangladesh, Thái Lan, Việt Nam, Indonexia, Malaysia (Chen et al, 2000) [40].
Theo Deng Qi-ming và cộng sự (2006) thì hầu hết các giống lúa kháng hiện nay có phổ kháng hẹp. Trên giống lúa Indica chứa gen Xa4 và giống Japonica chứa gen xa3 [52]. Theo Guang-huai Jiang và cộng sự (2006), gen lặn xa5 có phổ kháng rộng hơn và cao hơn so với các ựơn gen kháng khác. Các nhà khoa học Philippin thì khẳng ựịnh gen xa5, Xa7, Xa21, Xa23 có phổ kháng rộng hơn với cả 6 chủng bạc lá ở Philippin [72], (Chen et al, 2008) [97]. Theo Mark Mazzola và cộng sự, gen Xa21
kháng với hầu hết các chủng bạc lá ở Ấn độ và Philippin (Supanyika Sengsai et al, 2007) [101], (Sun et al, 2004) [120]
Từ cuối thế kỷ 20 ựến ựầu thế kỷ 21, một loạt các gen kháng vi khuẩn bạc lá ựược lập bản ựồ với các chỉ thị phân tử liên kết ựã thúc ựẩy mạnh mẽ chương trình chọn giống lúa kháng bạc lá nhờ chỉ thị phân tử. Các ựơn gen kháng vi khuẩn bạc lá thường chỉ kháng ựược với một số chủng vi khuẩn bạc lá nhất ựịnh. Vì vậy nhiều cơ sở nghiên cứu ựã tiến hành quy tụ vài gen kháng vi khuẩn bạc lá vào một giống lúa nhằm tạo giống lúa cho năng suất cao và kháng bền vững với nhiều chủng bạc lá. Công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) trở nên ựắc lực cho việc quy tụ nhiều gen kháng vào 1 hệ gen.
Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế ựã ựưa các gen kháng ựược với nhiều chủng bạc lá xa5, xa13 và Xa21 vào các giống lúa ỘKiểu mớiỢ (New Plant Type) IR65598-
112, IR65600-42 và IR65600-96 nhằm tạo ra các giống lúa cho năng suất siêu cao và kháng bền vững với bệnh bạc lá (Sanchez et al., 2000). Bằng con ựường MAS, các nhà khoa học ựã quy tụ ựược một số dòng lúa mang 2, 3 hoặc 4Ầ gen kháng bệnh bạc lá như các dòng mang ựa gen kháng IRBB57, IRBB62, IRBB60Ầcủa viện lúa quốc tế IRRI (Lang et al, 2008)[72].
Các nhà khoa học Philippin ựã quy tụ thành công 3 gen kháng trội vào dòng mẹ bất dục ựực phản ứng với nhiệt ựộ TGMS1 (Loida et al, 2008) [77].
Ở Ấn độ các nhà khoa học ựã quy tụ kết hợp 2 gen Xa4 và Xa21 vào cùng một giống lúa (Davierwala et al, 2001). Họ sử dụng phương pháp MAS ựể chuyển gen Pi5 và gen Xa21 vào giống lúa trồng IR50 (Narayanan et al, 2002) [84], quy tụ gen Xa21 và xa13 vào giống lúa Pusa Basmati1 tạo ra giống lúa mới Pusa 1460 (IET18990) kháng tốt với bệnh bạc lá. Sing et al (2007), ựã sử dụng MAS ựể quy tụ 3 gen kháng: xa5, xa13, Xa21 vào giống lúa trồng PR106. Một chương trình MAS ựược thiết lập nhằm tạo giống lúa kháng bền vững với các chủng bạc lá lúa ở Ấn độ [98].
Các nhà khoa học Trung Quốc ựã sử dụng MAS trong chọn giống lúa và họ ựã quy tụ ựược vài gen kháng chủ yếu như xa5, Xa7, Xa21Ầ vào cùng một giống lúạ Dòng phục hồi Shuhui 207 ựược quy tụ 2 gen trội kháng bạc lá Xa4, Xa21, qua kiểm tra thấy khả năng kháng cao hơn và có phổ kháng rộng hơn so với dòng chưa ựược quy tụ gen kháng ban ựầu Mianhui 725 (Wang et al, 2009) [50]. Kết quả sử dụng MAS ( RFLP) ựể chuyển gen Xa21 vào dòng phục hồi Minghui63, tạo thành dòng Minghui(Xa21) khi lai với Zhenshan 97A tạo con lai Shanyou 63 (Xa21) kháng ựược với bệnh bạc lá cho trọng lượng hạt và năng suất cao hơn dòng ựối chứng Shanyou 63Ầ.Các nhà khoa học Trung Quốc còn chuyển gen BT và gen
Xa21 vào giống lúa 9311 (Yuging et al, 2008) [126]Ầ
Các nhà khoa học Thái Lan ựã sử dụng MAS chọn tạo ựược nhiều giống lúa mới vừa cho năng suất cao, chất lượng tốt, ựặc biệt kháng ựược bệnh bạc lá, rầy nâụ..hơn hẳn giống Khoa Dok Mali truyền thống (Theerayut Toojinda et al, 2004) [108].
đối với các giống lúa Japonica canh tác tại Hàn Quốc, dòng pyramid với tổ hợp 3 gen kháng (Xa4 + xa5 + Xa21) tỏ ra kháng rất hiệu quả với tất cả các chủng vi khuẩn bạc lá, kể cả chủng ựộc K3a mới phân lập. Tổ hợp 3 gen kháng này dường như có biểu hiện thêm hiệu ứng kháng bổ trợ số lượng (quantitative complementation) (Jena et al, 2007) [71]. Kết quả này ựưa ra một chiến lược mới trong chọn tạo giống lúa Japonica có phổ kháng rộng ựối với các chủng bạc lá. Các nhà khoa học Hàn Quốc còn sử dụng các chỉ thị phân tử STS và SNP liên kết với các gen kháng Xa1, Xa4, xa5, xa13 và Xa21 trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bạc lá (Kim et al, 2009) [67].
1.3.2.4.2 Nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam
Bệnh bạc lá phát hiện ở Việt Nam sau năm 1954, trên các giống lúa ựịa phương cao cây, nhưng mức ựộ gây hại không nghiêm trọng. Khi phong trào thâm canh lúa phát triển, ựặc biệt là việc gieo trồng các giống lúa ựịa phương năng suất cao, chịu phân tốt, kết hợp với sử dụng nhiều phân bón hóa học là nguyên nhân chắnh dẫn ựến bệnh bạc lá phát triển lan tràn trong cả vụ xuân và vụ mùạ Vắ dụ: Năm 1970 trên diện tắch lúa mùa cũ cấy giống nông nghiệp 8 bị bệnh ở mức ựộ 60 -