3.6.1.1. Tiến hành
Lấy 1L dịch tinh chế, cô giảm áp đến cao đặc. òa cao đặc này vào 100 ml ethyl acetat bão hòa nước, để lắng, gạn lấy phần dịch trong. Thêm tiếp 50 ml ethyl acetat bão hòa nước vào phần cắn còn lại, lắc đều. au đó để lắng và gạn lấy phần dịch trong. Tiếp tục chiết phần cắn còn lại với 50ml ethyl acetat bão hòa nước như trên, để lắng và lọc lấy dịch. Gộp các dịch lọc, cô giảm áp ở 50C đến 50ml.
Chuyển phần dịch này vào bình gạn 250ml. Lắc 2 lần, mỗi lần với 100ml nước ấm, trong 15 phút, sau đó gạn lấy phần nước ở lớp dưới. Gộp các dịch chiết nước, cô giảm áp ở 70C đến thể tích khoảng 120 ml thấy xuất hiện tủa thì dừng lại, để qua đêm ở điều kiện phòng, lọc thu tủa. Phần dịch còn lại dùng để phân lập puerarin. Tủa thu được đem kết tinh lại trong 10ml ethanol 50% được daidzin tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng. Cân khối lượng daidzin thu được, thử độ tinh khiết bằng ình 3.6. ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết
50
sắc ký lớp mỏng theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2 và khẳng định cấu trúc theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.
3.6.1.2. Kết quả
Khối lượng daidzin thu được: 262,5mg/mẻ. Thực hiện 5 mẻ, thu được tổng lượng daidzin là 1,31 g
Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng thu được như hình 3.8. Trong đó A là mẫu thử daidzin, C là mẫu chuẩn puerarin 82,31%. Từ hình ảnh sắc ký lớp mỏng này có
ình 3.7. Quy trình phân lập daidzin và puerarin
Chiết 2-3 lần Lọc ước Kết tinh lại Cô giảm thể tích Làm lạnh Dịch tinh chế Cao đặc
Dịch chiết ethyl acetat
Dịch chiết nước Lắc 2-3 lần, gạn. Tủa daidzin Cô giảm áp Tủa puerarin Ethylacetate bão hòa nước Tủa ước ấm (70-80C) Dung dịch ethylacetat Dịch chiết nước ấm Để nguội Daidzin Ethanol 50% Kết tinh lại Puerarin
51
thể thấy, daidzin thu được khá tinh khiết, trên hình ảnh sắc ký không thấy có xuất hiện vết lạ, vết sắc ký gọn, sạch.
Xác định các thông số vật lý của tủa daidzin thu được kết quả như sau Cảm quan: Tủa daidzin thu được có dạng bột trắng, hơi vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 238,8°C (tài liệu [21]: 238-240°C)
Khẳng định lại cấu trúc của daidzin bằng các phương pháp phổ thu được kết quả như sau.
Phổ hồng ngoại - IR
Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.1 thu được kết quả như Phụ lục 13. Quan sát trên hình ảnh phổ thu được nhận thấy có các dải phổ hấp thụ đặc trưng như bảng sau :
Bảng 3.12. Kết quả đo phổ hồng ngoại của daidzin
Tên chất Đỉnh hấp thụ đặc trưng Nhóm chức tương ứng
Daidzin
3425 cm-1 , pic rộng và tù O─ phenol
1635 cm-1 C=O
1519 cm-1 C=C thơm
Phổ khối lượng (ESI-MS)
52
Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.2 thu được kết quả như hụ lục 14-15.
Bảng 3.13. Kết quả đo phổ khối lượng (E I-MS) của daidzin
Tên chất Số khối của mảnh ion phân tử m/z
Daidzin Phổ positive xuất hiện pic 438,96 ứng với mảnh [M+Na]+
có số khối là 438,96, tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19)
Phổ negative xuất hiện pic 415,00 ứng với mảnh [M-H]- có số khối là 415,00 tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19)
Nhận xét : Kết quả cho thấy các chất phân tích cho mảnh ion phân tử phù hợp với
khối lượng phân tử tương ứng.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.3 thu được kết quả như Phụ lục 16-19.
ình 3.9. Công thức cấu tạo của daidzin Bảng 3.14. Kết quả đo phổ R của daidzin
13 C NMR 1H NMR C Thực nghiệm (500 MHz, DMSO, ppm) Tài liệu [22] (125 MHz, DMSO, ppm) Thực nghiệm (500 MHz, DMSO, ppm) Tài liệu [22] (500 MHz, DMSO, ppm) 2 153,2 153,1 8,34 s 8,35 s 3 123,7 123,7 4 174,7 174,7 5 126,9 126,9 8,03 d (J 9,0) 8,05 d (J 8,8) 6 115,5 115,4 7,13 dd (J 7,0; 2,0) 7,14 dd (J 8,8; 2,4) 7 161,3 161,3 8 103,3 103,3 7,22 d (J 2,0) 7,22 (J 2,4) O OH O O O OH OH HO OH 1' 2 3 4 5 6 7 8 9 4' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''
53 9 157,2 157,2 10 118,4 118,5 1’ 122,3 122,2 2’ 130,0 129,9 7,40 d (J 8,5) 7,41 d (J 8,7) 3’ 114,9 114,9 6,81 d (J 8,5) 6,82 d (J 8,7) 4’ 157,0 157,0 5’ 114,9 115,5 6,84 d (J 8,5) 6’ 130,0 129,9 7,35 d (J 8,5) 1’’ 100,0 100,1 5,09 d (J 7,0) 5,09 d (J 7,5) 2’’ 73,1 73,1 3,27-3,33 m, 2H 3,44-3,48 m, 2H 3,70-3,74 m, 1H 3,20; 3,30-3,36 m 3,44-3,52 m 3,74 m; 3,46 m 3’’ 76,4 76,4 4’’ 69,6 69,6 5’’ 77,2 77,2 6’’ 60,6 60,6 OH 4,59; 5,06-5,13; 5,42; 9,54 (OH-4’) 4,58; 5,04; 5,10; 5,39; 9,48 3.6.2. Phân lập puerarin 3.6.2.1. Tiến hành
Dịch lọc còn lại sau khi đã loại tủa daidzin như mục 3.6.1.1 đem cô bớt còn khoảng 40ml, sau đó làm lạnh trong tủ lạnh qua đêm, thu được tủa puerarin thô. Tủa này được kết tinh lại trong khoảng 10 ml nước để thu puerarin có độ tinh khiết cao. Cân khối lượng puerarin thu được, thử độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2 và khẳng định cấu trúc theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.
3.6.2.2. Kết quả
Khối lượng puerarin thu được: 432,5mg/mẻ. Thực hiện 5 mẻ, thu được tổng lượng puerarin là 2,16 g
Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng thu được như hình 3.10. Trong đó B là mẫu thử puerarin, C là mẫu chuẩn puerarin
Hình 3.10. ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin
54
82,31%. Từ hình ảnh sắc ký lớp mỏng này có thể thấy, puerarin thu được có độ tinh khiết cao, hình ảnh sắc ký không thấy có xuất hiện vết lạ, vết sắc ký gọn, sạch.
Xác định các thông số vật lý của tủa daidzin thu được kết quả như sau Cảm quan: dạng bột trắng, hơi vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 210°C (tài liệu [24]: 208,4-212,5°C)
Rf = 0,388 với pha động là Cloroform - methanol - nước (7:2,5:0,25).
Rf = 0,589 với pha động là Cloroform – methanol (7:3).
Khẳng định lại cấu trúc của puerarin bằng các phương pháp phổ thu được kết quả như sau.
Phổ hồng ngoại - IR
Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.1 thu được kết quả như Phụ lục 5. Quan sát trên hình ảnh phổ thu được nhận thấy có các dải phổ hấp thụ đặc trưng như bảng sau :
Bảng 3.15. Kết quả đo phổ hồng ngoại của puerarin
Tên chất Đỉnh hấp thụ đặc trưng Nhóm chức tương ứng
Puerarin
3341 cm-1, pic rộng và tù O─ phenol
1635 cm-1 C=O
1513 cm-1 C=C thơm
Phổ khối lượng (ESI-MS)
Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.2 thu được kết quả như hụ lục 6-7..
Bảng 3.16. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của puerarin
Tên chất Số khối của mảnh ion phân tử m/z
Puerarin Phổ negative xuất hiện pic 415,08 ứng với mảnh [M-H]-
có số khối là 438,96, tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19)
Phổ positive xuất hiện pic 417,08 ứng với mảnh [M+H]+ có số khối là 417,08, tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19)
Nhận xét : Kết quả cho thấy chất phân tích cho mảnh ion phân tử phù hợp với
55 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.3 thu được kết quả như hụ lục 8-12.
ình 3.11. Công thức cấu tạo của puerarin Bảng 3.17. Kết quả đo phổ R của puerarin
13 C NMR và DEPT 1H NMR C Thực nghiệm (500 MHz, CD3OD, ppm) Tài liệu [22] (125 MHz, DMSO, ppm) Thực nghiệm (500 MHz, CD3OD, ppm) Tài liệu [22] (500 MHz, DMSO, ppm) 2 154,4 (CH) 152,0 8,15 s 8,26 s 3 125,4 (C) 122,9 4 178,2 (C) 174,6 5 128,0 (CH) 125,9 8,03 d (J 9,0) 7,96 d (J 8,8) 6 116,2 (CH) 114,8 6,97 d (J 9,0) 6,99 dd (J 8,8) 7 162,9 (C) 160,6 8 113,0 (C) 113,2 9 158,5 (C) 155,7 10 118,4 (C) 116,8 1’ 124,1 (C) 122,4 2’ 131,3 (CH) 129,6 7,35 d (J 8,5) 7,42 d (J 8,8) 3’ 116,2 (CH) 114,7 6,84 d (J 8,5) 6,82 d (J 8,8) 4’ 158,5 (C) 156,9 5’ 116,2 (CH) 114,7 6,84 d (J 8,5) 6’ 131,3 (CH) 129,6 7,35 d (J 8,5) 1’’ 75,6 (CH) 73,4 5,11 (J 9,5) 4,90 d (J 10,4) 2’’ 72,99 (CH) 70,9 3,51-3,54 m, 1H 3,34m; 3,54m O OH HO O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 4' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O HO HO OH OH
56 3’’ 79,9 (CH) 78,5 3,56-3,58 m, 2H 3,77 dd, 1H 3,89-3,93 m, 1H 4,14 br, 1H 3,55br, d 3,74br, d 3,75m; 4,0m 4’’ 71,6 (CH) 70,2 5’’ 82,6 (CH) 81,2 6’’ 62,7 (CH2) 61,1 OH 4,68
Nhận xét : Các dữ liệu phổ và hằng số vật lý của mẫu puerarin chiết được là đồng
nhất với dữ liệu phổ và hằng số vật lý từ các tài liệu tham khảo và phù hợp với cấu trúc của puerarin. Kết quả đo phổ cũng cho thấy puerarin và daidzin phân lập được là tinh khiết.
57
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1.Về nguyên liệu chiết xuất isoflavonoid
Đề tài đã thực hiện khảo sát chiết isoflavonoid từ cả hai nguyên liệu sắn dây khô và sắn dây tươi thu mua ở các tỉnh Hải Dương, inh Bình và hú Thọ. Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy, sắn dây thu mua ở Phú Thọ cho hàm lượng isoflavonoid và puerarin cao nhất, được đưa vào nghiên cứu.
Đề tài mới chỉ thực hiện những khảo sát và nghiên cứu bước đầu về chiết isoflavonoid và puerarin từ sắn dây, do vậy chưa chủ động được nguồn nguyên liệu. Kết quả nghiên cứu phụ thuộc nhiều vào chất lượng nguyên liệu đầu vào. Cần có thêm nghiên cứu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu về các tiêu chí như hàm lượng isoflavonoid, thời gian thu hái, độ tuổi của sắn dây khi thu hái, quy trình làm khô dược liệu…
Với sắn khô, đã tiến hành khảo sát các dung môi chiết là các dung dịch ethanol có nồng độ khác nhau và nước. Dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao hơn dung môi nước và có thể chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. Trong các nồng độ ethanol khảo sát, ethanol 60% tỏ ra là dung môi chiết hiệu quả: hiệu suất chiết isoflavonoid đạt 90,61%, cao sau tinh chế có hàm lượng isoflavonoid đạt trên 10%. Kết quả phù hợp với nhiều kết quả đã được công bố trong nước [5] và nước ngoài [41], [45]. Tuy nhiên, theo phương pháp khảo sát, chiết isoflavonoid bằng ethanol thực hiện trong thời gian kéo dài, ngoài sản phẩm chính là isoflavonoid thì không thu thêm được tinh bột.
Với sắn tươi chỉ cần sử dụng dung môi rẻ tiền, không độc là nước để chiết isoflavonoid cho hiệu quả chiết cao đạt 86,18%. Đặc biệt, quy trình chiết xây dựng được hoàn toàn có thể triển khai trên quy mô lớn, kết hợp với quy trình thu tinh bột thường sử dụng trong dân gian. Nguyên liệu được tận dụng tối đa để vừa thu tinh bột, vừa chiết isoflavonoid. Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình là chỉ sản xuất được theo thời vụ, vào mùa thu hoạch sắn dây.
58
Đề tài đã xây dựng được quy trình điều chế cao khô isoflavonoid bằng phương pháp phun sấy. hương pháp phun sấy có các ưu điểm:
Tiết kiệm thời gian, năng lượng (điện năng, nhiệt năng). Tránh phân hủy hoạt chất do tiếp xúc với nhiệt lâu.
Cao khô thu được ở dạng bột tơi xốp, dễ thu hồi, bảo quản và chất lượng đồng đều giữa các lô mẻ.
Dễ triển khai trên quy mô lớn.
Đề tài cũng đã đánh giá được một số đặc điểm cơ bản của cao khô phun sấy được. Trong khuôn khổ đề tài, việc phun sấy còn gặp một số khó khăn như
Mới chỉ thực hiện được trên dịch chiết nước của nguyên liệu tươi.
Cần một lượng lớn dịch chiết (42 lít), do điều kiện máy móc và thời gian hạn chế nên chỉ lựa chọn được phương pháp tinh chế đơn giản nhất để tiến hành tinh chế lượng dịch chế thu được mặc dù đó không phải là phương pháp cho hiệu quả tinh chế cao nhất.
Quá trình điều chế phải thực hiện qua hai giai đoạn ở hai nơi khác nhau, khó khăn trong việc vận chuyển, không chủ động được về máy móc, phụ thuộc nhiều vào nơi hợp tác (công ty cổ phần óa dược phẩm Việt Nam).
Cần tiến hành thêm nghiên cứu điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây khô để đảm bảo có thể sản xuất cao khô isoflavonoid liên tục trong năm khi nguồn nguyên liệu tươi không còn sẵn có.
4.3.Về phương pháp phân lập puerarin và daidzin
Hầu hết các phương pháp phân lập puerarin và daidzin đã được công bố [5], [42] đều sử dụng phương pháp sắc ký cột. hương pháp này cho sản phẩm có độ tinh khiết cao song chỉ tiến hành được với cỡ mẫu nhỏ, dung môi và hóa chất sử dụng đắt tiền, cho hiệu quả kinh tế không cao.
Đề tài đã xây dựng được quy trình đơn giản phân lập được cả puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây tươi. Quy trình thực hiện đơn giản, nhanh chóng, có thể tiến hành với các cỡ mẫu lớn.
59
Quá trình phân lập trải qua 4 giải đoạn. ai giai đoạn đầu nhằm mục đích loại các tạp bằng cách thay đổi dung môi. Do puerarin tan được trong nước, ít tan trong ethyl acetat còn daidzin tan tốt trong ethyl acetat nhưng lại tan kém hơn nhiều trong nước, sử dụng ethyl aceta bão hòa nước giúp cải thiện độ tan của puerarin do đó nâng cao hiệu suất phân lập so với khi chỉ sử dụng ethyl acetat. Qua hai lần thay đổi dung môi, kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng thấy tạp chất và các isoflavonoid không cần thiết đã được loại đi đáng kể.
Việc phân lập được daidzin là thành công nằm ngoài mục tiêu mong đợi ban đầu của đề tài.
Thực tế, đề tài mới thực hiện phân lập thành công puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây tươi do điều kiện thời gian có hạn. Cần có thêm nghiên cứu hoàn thiện quy trình phân lập puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây khô để có thể chủ động trong việc sản xuất không phụ thuộc vào mùa thu hoạch sắn dây tươi.
60
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Mặc dù do thời gian thực hiện và điều kiện thực nghiệm còn hạn chế, nghiên cứu đã đạt được các mục tiêu đề ra:
1. Xây dựng được quy trình điều chế cao khô phun sấy từ rễ củ sắn dây có
hàm lượng isoflavonoid trong cao trên 10%
Cụ thể, nghiên cứu đã
Khảo sát và lựa chọn được dung môi chiết isoflavonoid thích hợp từ sắn dây khô là ethanol 60%, tinh chế dịch chiết bằng nhiệt, hàm lượng isoflavonoid trong cao tinh chế đạt 10,41%
Xây dựng được quy trình chiết isoflavonoid và thu tinh bột từ sắn dây tươi bằng dung môi rẻ tiền, không độc là nước. Hiệu suất chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi đạt 86,18% sau 2 lần chiết. Khảo sát 3 phương pháp tinh chế dịch chiết là sử dụng nhiệt, sử dụng ethanol và phối hợp cả nhiệt và ethanol. Lựa chọn phương pháp tinh chế đơn giản, thuận tiện là sử dụng nhiệt để tinh chế dịch chiết đem vào điều chế cao khô phun sấy.
Xây dựng được quy trình điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy như hình 2.2. Cao khô điều chế được ở dạng bột, thể chất tơi xốp, đồng nhất, có màu vàng kem, mùi thơm, vị đắng hơi ngọt; khối lượng riêng biểu kiến là 0,52 g/cm3
; kích thước tiểu phân nhỏ hơn 250µm; hàm ẩm 2,7%; hàm lượng isoflavonoid trong cao đạt 10,78%.
2. Phân lập được puerarin và daidzin từ rễ củ sắn dây.
Cụ thể, nghiên cứu đã
Xây dựng được quy trình phân lập được puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây tươi đơn giản, hiệu quả. Sản phẩm phân lập có độ tinh khiết cao trên phổ. Cấu trúc của puerarin và daidzin tinh chế được được khẳng định bằng các phương pháp có độ tin cậy cao: phổ IR, phổ ESI – MS, phổ NMR.
61
ĐỀ XUẤT
Những kết quả đạt được của nghiên cứu chỉ là những thành quả khảo sát, thăm dò bước đầu trong việc đưa ra một quy trình chiết xuất isoflavonoid và phân lập puerarin, daidzin hoàn thiện từ sắn dây (khô và tươi). hóm nghiên cứu xin đề xuất cần có thêm những nghiên cứu cụ thể hơn như
1. Nghiên cứu chuẩn hóa nguyên liệu sắn dây đưa vào nghiên cứu
2. Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi và sắn dây khô
3. Nghiên cứu mở rộng quy trình chiết xuất isoflavonoid và phân lập puerarin, daidzin trên các quy mô lớn hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bộ Môn Công Nghiệp Dược (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập 1, tr.