2.3.1.1.Định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang
Qua tham khảo các tài liệu [11], [41], [45] chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần trong dược liệu và trong dịch chiết bằng quang phổ hấp thụ V như sau.
Cân chính xác khoảng 12,1 mg chất đối chiếu (chứa 82,31% puerarin) tương đương với khoảng 10,0 mg puerarin hòa tan trong khoảng 20ml ethanol 96%, sau đó chuyển vào bình định mức 50ml. Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung dịch A. Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch A cho vào bình định mức 25 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch, lắc đều được dung dịch chất đối chiếu có hàm lượng puerarin khoảng 8µg/ml. Lọc qua màng 0,45µm, quét phổ để chọn ra bước sóng thích hợp cho định lượng.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 20,0 ml dung dịch A cho
vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung dịch B. Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 1,6; 3,2; 4,8; 6,4; 8 µg/ml theo như bảng sau:
Nồng độ dung dịch
chuẩn (µg/ml) 1,6 3,2 4,8 6,4 8,0
Vdung dịch B (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 Vethanol 96% (ml) 8,0 6,0 4,0 2,0 0 Vnước cất (vđ) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
26
Mẫu trắng là dung dịch ethanol 19,2% (10ml dung dịch ethanol 96% pha loãng với nước cất vừa đủ 50ml). Mẫu trắng và mẫu chuẩn sau khi pha được lọc qua màng 0,45µm, đo độ hấp thụ tại bước sóng đã chọn, đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đường chuẩn.
Với mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu,
thêm 100 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 500 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 100 ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử.
Với mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 0,4 g dược liệu,
thêm 40 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 50 ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử.
Mẫu thử là cao đặc, cao khô: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao xác định
hàm lượng, hòa tan bằng ethanol 96%, chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều. Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm 9,0 ml ethanol 96% và bổ sung nước cất vừa đủ, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45µm trước khi đo quang.
Hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu được tính theo công thức sau:
27
At, Ac : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn
Vchiết : Thể tích dịch chiết K : Tích các hệ số pha loãng
mt : Khối lượng dược liệu đem vào chiết xuất. àm lượng isoflavonoid trong cao được tính theo công thức
Trong đó
At, Ac : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn
mcao : Khối lượng cao.
2.3.1.2.Định lượng puerarin bằng HPLC
Để định lượng puerarin trong nguyên liệu, cao khô toàn phần và sản phẩm tinh chế, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Qua tham khảo các tài liệu [29], [45], [16] và quá trình khảo sát ban đầu, chúng tôi lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau:
Thông số máy sắc ký:
Bộ phân loại khí DGU – 14A Bơm cao áp LC – 10ADVP Buồng chứa cột CTO – 10AVP Bộ điều khiển SCL – 10AVP
Detector dãy diod quang SPD – M10AVP Phần mềm Class vp 6.14.
Cột sắc ký Alltech C18 với kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm
ha động: methanol nước = 30:70, pha động được lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm trong 15 phút.
28 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
Thể tích tiêm mẫu: 5 µl
Detector UV phát hiện ở bước sóng 250 nm.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,125 g chất đối
chiếu puerarin 82,31%. Hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 100 ml. Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch được dung dịch A. Lấy chính xác khoảng 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nước cất được dung dịch B.
Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,01 mg/ml đến 0,2 mg/ml theo bảng sau: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml) 0,01 0,02 0,05 0,10 0,15 0,20 Vdd A (ml) - - - 1 1 2 Vdd B (ml) 1 2 5 - 5 - Vpha động vđ (ml) 10 10 10 10 10 10
Các dung dịch chuẩn này đều được lọc qua màng 0,45 µm trước khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 40 ml
ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 40 ml
ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử là cao đặc, cao khô: Cân chính xác khoảng 0,115g cao. Hòa tan trong khoảng 20ml ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 50 ml. Thêm
29
ethanol 96% vừa đủ đến vạch. Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động, sau đó lọc qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký.
àm lượng puerarin trong nguyên liệu, trong cao đặc và cao khô được tính theo công thức:
Trong đó
St, Sc : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)
V : Thể tích chiết hoặc thể tích dung dịch ban đầu pha mẫu thử. K : Hệ số pha loãng
mcân : Khối lượng dược liệu, khối lượng cắn hoặc cao khô cân thực tế.