1.2.5.1. Tinh chế bằng sắc ký
Sắc ký điều chế là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Các kỹ thuật sắc ký thường dùng là sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, sắc ký cột… u điểm của phương pháp sắc ký là tách được nhiều hoạt chất với độ tinh khiết cao.
ăm 1999, Xueli Cao và cộng sự đã sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao với hệ dung môi ethyl acetat – n-butanol – nước theo tỷ lệ 2:1:3 (v/v/v) tách được ngay 6 hợp chất tinh khiết từ 80 mg dịch chiết trong lần chạy sắc ký đầu tiên. Các hợp chất tinh chế được gồm 3’-hydroxyl-puerarin, puerarin, 3’- methoxy-puerarin, puerarin-xylosid, puerarin-xylosid, daidzin. Các chất tinh chế được có độ tinh khiết cao trên 90%, đáng kể nhất là puerarin có độ tinh khiết trên 98% [42].
ăm 2004, Xiangling He và cộng sự sử dụng sắc ký hấp phụ trên epichlorohydrin gắn ligand -cyclodextrin. ha động là dung dịch acid acetic 10%. Dung lượng phân tích khoảng 1,2 mg dịch chiết. uerarin thu được có độ tinh khiết khoảng 98% [40].
Có thể thấy, phương pháp sắc ký tách hoạt chất với độ tinh khiết cao (>90%) từ một lượng rất nhỏ dịch chiết (<100mg). hương pháp này thích hợp để tinh chế ra chất chuẩn cho định lượng nhưng với lượng mẫu nhỏ khó triển khai trên quy mô lớn.
20
Mặc dù phương pháp tinh chế bằng sắc ký cho ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao song chỉ thực hiện với cỡ mẫu nhỏ, chi phí tốn kém chủ yếu dùng nghiên cứu thành phần của dược chất hơn là tinh chế sản xuất trên quy mô công nghiệp. Và do vậy, bên cạnh phương pháp sắc ký người ta luôn phải nghiên cứu tìm ra các phương pháp tinh chế hoạt chất khác rẻ tiền, dễ triển khai trên quy mô lớn với mức độ tinh khiết chấp nhận được.
hương pháp đơn giản nhất có thể kể đến đó là phương pháp của Hua- Neng Xu và cộng sự. Chiết rễ củ sắn dây Pueraria lobata bằng hỗn hợp dung môi n-butanol/nước (1:1) ở 25C trong 6 giờ. Dịch chiết thu được để lắng cho tách pha thu lấy phần nước để tinh chế puerarin (daidzein phân bố chủ yếu ở pha n-butanol). Phần dịch này được lắc với n-butanol trong 1 giờ, sau đó điều chỉnh pH của pha nước bằng acid HCl về 4,0, lúc này puerarin sẽ chuyển sang pha n- butanol. Thu lấy pha n-butanol, tiếp tục lắc với đồng thể tích nước trong 1 giờ, pH của pha nước được điều chỉnh về giá trị 8,0. Lúc này puerarin lại chuyển sang pha nước. Thu lấy phần chiết nước. Phân tích HPLC cho thấy sau 2 lần chuyển pha puerarin thu được tương đối tinh khiết [16].
Tại Việt Nam, tinh chế puerarin từ dịch chiết sắn dây chưa được quan tâm nghiên cứu mặc dù đây là thành phần chiếm hàm lượng lớn và cho tác dụng sinh học chủ đạo của sắn dây. Hiện tại chỉ có duy nhất nghiên cứu của Dược sĩ Lê Thùy Linh đã tiến hành tinh chế được daidzein bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi CCl3 : Methanol (98:2) [5].