Nguyên tắc: ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật chẩn đoán quan trọng và phổ biến nhất hiện nay so với các kỹ thuật huyết thanh học khác. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng nhƣ lƣợng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên/kháng thể) ngƣời ta sử dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này đƣợc đánh dấu bằng enzyme sao cho phản ứng miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán sẽ tạo nên sự thay đổi có thể nhận biết đƣợc bằng mắt thƣờng hay thậm chí định lƣợng đƣợc bằng các công cụ so màu khác khi cho cơ chất của enzyme đánh dấu vào.
Các bƣớc tiến hành:
- Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền mẫu cây trong đệm phủ và cho 100l/giếng, ủ bản ELISA qua đêm ở 4-6oC trong hộp ẩm. Rửa 3 lần bằng đệm rửa. Protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành giếng.
- Cố định kháng thể sơ cấp đặc hiệu virus vào bản ELISA: Hoà kháng đặc hiệu virus trong đệm huyết thanh và cho 100l/giếng. Ủ bản ELISA ở 25oC trong 1- 2 giờ. Rửa bản ELISA nhƣ bƣớc 1.
- Cố định kháng thể thứ cấp liên kết với Alkaline Phosphatase (AP) vào bản ELISA: Hoà kháng thể thứ cấp trong đệm liên kết và cho 100l/giếng. Ủ khay mẫu ở 25oC trong 1-2 giờ.
- Cố định chất nền vào bản ELISA: Hoà chất nền trong đệm chất nền Nitrophenyl phosphate (NPP) theo tỷ lệ 0,6 mg/ml và cho giếng với lƣợng 100
l/giếng. Bản ELISA đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong tối khoảng 60 phút cho tới khi hiện màu. Phản ứng hoá học ở đây là NPP sẽ bị thuỷ phân thành Nitrophenol phosphate dƣới sự xúc tác của enzyme AP. Nitrophenol phosphate là chất có màu vàng, do vậy có thể nhận biết đƣợc bằng mắt hoặc bằng máy đọc ELISA (máy so màu). Ngừng phản ứng thuỷ phân bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 3M với lƣợng 25-50 l/giếng.
37
CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN P10 TỪ cDNA CỦA PHÂN ĐOẠN S10 3.1.1. Nhân bản đoạn gen P10 bằng phản ứng PCR