Nguyên tắc: dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Kháng thể (kháng thể sơ cấp) sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể, tiếp tục đƣợc nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme photphatase kiềm, cuối cùng phức hợp kháng nguyên – kháng thể sơ cấp – kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ không màu thành sản phẩm có màu, dễ đàng nhận biết bằng mắt thƣờng.
34
- Protein sau khi đƣợc tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose bằng phƣơng pháp điện chuyển trong đệm Tris-glycin có 20% methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein vẫn đƣợc giữ nguyên.
- Cố định màng bằng dung dịch BSA 1% trong Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, có NaCl 150 mM (TBS) bằng cách lắc nhẹ (30 phút - 1 giờ) ở 37oC.
- Tráng rửa màng (3 lần) bằng đệm TBS để loại bỏ BSA thừa. - Ủ màng với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC.
- Loại bỏ kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng bằng cách tráng rửa màng trong đệm TBS. Sau đó ủ màng với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase kiềm.
- Hiện màu các băng protein bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p- nitro blue tetrazolium chloridel 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphat (NBT/BCIP) pha trong đệm TBS pH 9,0 có MgCl2 5 mM. Đến khi các băng hiện rõ thì ngừng phản ứng bằng đệm TBS có chứa 20 mM EDTA.